论文总字数：20824字

摘 要

在当前能源枯竭以及分布不均的现状下，可再生生物质能源，廉价木质纤维素的降解及发酵生产乙醇成了人们关注的热点。纤维素降解酶作为降解纤维素生物的主要途径之一，因降解酶的生产需要较高成本，阻碍了木质纤维素的高效利用。

黑曲霉(Aspergillus Niger)作为工业上重要的发酵菌种，可生产纤维素酶、木聚糖酶之类的多种酶。在自然界里能找到大量木聚糖(xylan)的身影，同时它作为一种异质多糖存在植物类别的细胞壁里。此外，木聚糖与之相关的水解酶系统可将半纤维素转化成溶剂、燃料等物质。转录因子XlnR通过外部碳源诱导物信号的传递来响应纤维素酶的激活或抑制作用。本文通过在黑曲霉中过表达XlnR转录因子以达到提高木聚糖酶的酶活力的目的。结论如下：

在黑曲霉中通过原生质体化学转化的方法过表达同源转录因子XlnR，本实验挑选了4株过表达黑曲霉菌株，分别命名为OEXlnR2、OEXlnR4、OEXlnR5、OEXlnR6。利用摇瓶实验，在麸皮和玉米芯的天然培养基下发酵，结果显示，4.5 d时菌株产木聚糖酶的酶活力出现了本实验中前所未有的高点，在所得结果中，野生菌株的木聚糖酶的酶活是789.05 U/mL，OEXlnR5菌株的酶活是867.66 U/mL，OEXlnR4菌株的酶活是944.02 U/mL，与野生型菌株相比，OEXlnR4、OEXlnR5在4.5 d时产木聚糖酶酶活力分别提高9.96%和19.65%。

关键词：XlnR转录因子 能源 木聚糖酶 黑曲霉

Effect of overexpression of transcription factor XlnR on xylanase production by Aspergillus niger

ABSTRACT

In In the current state of energy depletion and uneven distribution, renewable biomass energy, degradation of cheap lignocellulose and ethanol production by fermentation have become the focus of attention. Cellulose-degrading enzymes are an important means of biodegradation of lignocellulose. Due to the high cost of cellulose degrading enzyme production, the efficient utilization of lignocellulose is hindered.

Aspergillus niger is an industrially important fermentation strain that produces a variety of enzymes such as cellulase and xylanase. A large number of xylans can be found in nature, and it exists as a heterogeneous polysaccharide in the cell wall of the plant class. In addition, the hydrolytic enzyme system associated with xylan converts hemicellulose into solvents, fuels, and the like. The transcription factor XlnR responds to the activation or inhibition of cellulase by the transmission of an external carbon source inducer signal. This article aims to increase the enzyme activity of xylanase by overexpressing the XlnR transcription factor in Aspergillus niger. conclusion as below:

In the Aspergillus niger, the homologous transcription factor XlnR was overexpressed by protoplast chemical transformation. Four strains of overexpressed Aspergillus niger were selected and named as OEXlnR2, OEXlnR4, OEXlnR5 and OEXlnR6. Using the shake flask experiment, fermentation under the natural medium of bran and corn cob showed that the enzyme activity of the xylanase produced by the strain showed an unprecedented high point in this experiment at 4.5d. Among the results, the wild strain was obtained. The enzyme activity of xylanase was 789.05 U/mL, the enzyme activity of OEXlnR5 strain was 867.66 U/mL, and the enzyme activity of OEXlnR4 strain was 944.02 U/mL. Compared with the wild type strain, OEXlnR4 and OEXlnR5 were 4.5 d. The xylanase-producing enzyme activity increased by 9.96% and 16.65%, respectively.

Keywords: XlnR transcription factor; Energy; Xylanase; Aspergillus niger

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 能源需求及可再生能源的利用 1

1.1.1 能源现状 1

1.1.2 可再生能源现状 2

1.2 黑曲霉(Aspergillus niger) 2

1.2.1 黑曲霉的来源与简介 2

1.2.2 黑曲霉的应用 3

1.2.3 黑曲霉的开发前景 3

1.3 木聚糖酶（Xylanase） 4

1.3.1 木聚糖酶的简介及组成 4

1.3.2 木聚糖酶的来源 4

1.3.3 木聚糖酶的研究现状 5

1.3.4 木聚糖酶的应用 5

1.4 XlnR转录因子 6

1.5 本论文研究的目的及意义 6

1.5.1 研究目的 6

1.5.2 研究意义 7

第二章 实验材料和方法 8

2.1 菌种 8

2.2 实验试剂 8

2.3 实验仪器 9

2.4 缓冲液、培养基及常用试剂的配制 10

2.4.1 缓冲液 10

2.4.2 培养基 10

2.4.3 常用试剂 11

2.5 提取黑曲霉基因组 11

2.6 构建质粒 11

2.6.1 酶切 11

2.6.2 一步克隆 12

2.6.3 大肠转化 13

2.6.4 提质粒以及酶切验证 13

2.7 黑曲霉原生质体转化 14

2.7.1 制备孢子悬液 14

2.7.2 配制酶液 14

2.7.3 转化 14

2.8 菌落PCR 15

2.9 发酵 15

2.10 发酵检测方法 15

第三章 实验结果和讨论 17

3.1 黑曲霉基因组的提取 17

3.2 质粒的构建 17

3.2.1 提质粒 17

3.2.2 酶切验证 18

3.3 原生质体转化 18

3.4 菌落PCR验证 19

3.5 发酵检测 19

第四章 结论以及展望 21

4.1 结论 21

4.2 展望 21

参 考 文 献 22

致 谢 25

第一章 文献综述

能源是人类生存的重要保障，是国家发展的必要基石，然而却在全球经济的飞速发展中逐渐枯竭，加之化石能源的过度开采造成了严重的环境问题以及矿石能源的日益枯竭[1]。因此，可再生生物质可以生产生物能源和生物基化学品，这一用处对实现可持续经济发展至关重要。作为地球上最丰富、最廉价的可再生生物质能源，木质纤维素生物质降解和发酵产生燃料乙醇成为世界各国学者关注的焦点[2]。木质纤维素通过多种木质素共同组成，它们之间形成一种稳固不易被破解的结构，具有能够很好抵抗外界侵入的优良特性，因此在利用木质纤维素的第一步就是要将其使用木质纤维素降解酶水解，从而释放可发酵糖。当前降解木质纤维素的酶的成本过高遏制了木质的纤维素原料的高效生物降解应用，因而，研究怎样才能使木聚糖酶的高速大量产生逐渐成为了目前生物技术研究的主要内容。

1.1 能源需求及可再生能源的利用

能源需求是指愿意并能够以各种可能的价格购买能源的消费者数量；是引致需求，能源的价值由其提供服务的能力决定。在此阶段，中国社会主义市场经济发展迅速，社会生产和群众对于各类能源的需求不断增长，能源产业的良好发展对促进国民经济发展具有重要意义。因此，想要实现国民全面生产总值的提高，需要发扬经济、稳定、清洁的能源优势，给社会发展提供所需的物质保障。能源在社会整体发展中发挥着重要作用，是现代社会各领域稳步发展的基本条件。可持续能源供应是促使社会可持续发展的重要推动力。当前，人的发展、社会的不断不前进以及大自然的不断被破坏致使人们认识到了三者协调发展共同进步的必要性，此等关系不断使人们绞尽脑汁来寻求平衡的方法[3]。在需要平衡人与自然、社会互惠互利发展的情况下，生物质能作为一种可持续的可再生的清洁能源受到了世界各国的极大关注。

1.1.1 能源现状

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