论文总字数：18565字

摘 要

TF（转录因子）是真菌发育、孢子分生的关键因子，在转录相关通路的调控中，许多转录因子扮演者重要的作用。例如：调节分生和发育、对环境的适应、宿主免疫系统的作用等。TF功能的丧失可能会使一些真菌的负担和免疫反应发生异常。目前，对特定TFs的体外研究以及确定了它们的相关功能，但是其体内的功能还未被完全研究。对生物膜而言，stuA的缺失会通过改变细胞壁的结构来调控生物膜的形成机制，所以，对TF的研究对发酵生产具有重要意义。

本课题选择产黄青霉作为原始菌株，找到目标基因stuA，利用同源重组的方法敲除stuA基因，以此来探究基因对产黄青霉生物膜形成机制的影响。再通过CR、CFW生物膜抗逆性实验以及结晶紫染色实验，意外的是，发现stuA会一直产黄青霉成膜能力，这个结果与其他的菌种不同。通过固定化发酵实验发现，stuA敲除菌消耗葡萄糖的量以及青霉素的产量都较野生菌高，而游离发酵时，两者相差却不大，由此也可以发现，生物膜对固定化发酵有着重要的作用。

关键词：产黄青霉 生物膜 基因敲除 固定化

Abstract

TF (transcription factor) is a key factor for fungal development and spore meristem. In the regulation of transcription-related pathways, many transcription factors play an important role. For example: regulation of meristem and development, adaptation to the environment, the role of the host's immune system, etc. The loss of TF function may make the burden and immune response of some fungi abnormal. At present, in vitro studies on specific TFs and their related functions have been determined, but their functions in vivo have not been fully studied. For biofilms, the loss of stuA will regulate the mechanism of biofilm formation by changing the structure of the cell wall, so the study of TF has important significance for fermentation production.
In this project, Penicillium chrysogenum was selected as the original strain, the target gene stuA was found, and the stuA gene was knocked out by homologous recombination to explore the effect of the gene on the biofilm formation mechanism of Penicillium chrysogenum.Then through CR, CFW biofilm resistance experiment and crystal violet staining experiment, it was unexpectedly found that stuA will always produce Penicillium chrysogenum film forming ability, this result is different from other strains. Through the immobilized fermentation experiment, it was found that the amount of glucose consumed by stuA knockout bacteria and the yield of penicillin were higher than those of wild bacteria, but during free fermentation, the difference between the two was not much. It can also be found that biofilms have a role in immobilized fermentation Important role.

Keywords: Penicillium chrysogenum ；biofilm ；gene knockout； immobilization

目录

摘要 3

Abstract 4

第一章 文献综述 1

1.1 选题背景 1

1.1.1 青霉素的理化性质 1

1.1.2 青霉素的药理作用 1

1.1.3 青霉素的当前市场背景 1

1.2 产黄青霉 1

1.3 stuA 1

1.4 真菌生物膜 1

1.4.1 生物膜的形成过程 1

1.5 固定化发酵 2

1.5.1细胞固定化技术 2

1.5.2 固定化发酵的应用 1

1.6 本论文主要研究内容 2

第二章 实验部分 1

2.1菌株和质粒 1

2.2仪器与设备、药品 1

2.3缓冲液 3

2.4 活化产黄青霉 3

2.4.1 培养基 3

2.4.2 实验方法 4

2.5 stuA的基因敲除 4

2.5.1设计引物 4

2.5.2 PCR扩增 5

2.5.3 三个片段的融合 5

2.5.4 产黄青霉原生质体制备与转化 6

2.6产黄青霉生物膜抗逆性实验 6

2.6.1 培养基 6

2.6.2 实验方法 7

2.7 产黄青霉结晶紫染色实验 7

2.7.1 培养基 7

2.7.2 实验方法 7

2.8 固定化发酵 8

2.8.1 培养基 8

2.8.2 发酵流程 8

2.8.3 HPLC参数 9

第三章 结果与分析 10

3.1 产黄青霉stuA的基因敲除 10

3.2 生物膜抗逆性实验 11

3.3 结晶紫染色验证 13

3.4 固定化发酵 14

第四章 结论与展望 17

4.1 结论 17

4.2 展望 17

参考文献 19

致谢 21

第一章 文献综述

1.1 选题背景

1.1.1 青霉素的理化性质

青霉素（Penicillin）是一种抗生素，结构上属于β－内酰胺类，它是一些丝状真菌的次级代谢产物，例如产黄青霉，纳地青霉以及构巢曲霉等^[1]。产黄青霉不需要流加特殊的侧链前体，就能将苯丙氨酸转化成苯乙酸，苯乙酸可进一步转化成青霉素G，但是，青霉素的其余组分，需要流加不同的侧链前体，才能完成合成的过程，因此青霉素G就是我们平常所说的青霉素^[2]，故青霉素的合成不是一步完成的。

纯品青霉素G是白色粉末，不溶于水，但是它的盐化合物例如钾盐、钠盐，易溶于水。并且干燥时耐热性强且性质稳定，可保存两至三年，但是其溶液稳定性却很弱，所以青霉素溶液要及时使用，不可长期保存。青霉素的抗菌活性很不稳定，其分子中含有极易被破坏的β－内酰胺环，例如：酸、碱以及各种氧化剂。

1.1.2 青霉素的药理作用

1929年，Fleming一次偶然的机会发现了青霉素，之后，Chain和Florey进一步研究，终于提取了纯品的青霉素，由于其很强大的抗菌作用，青霉素在临床上被大量使用。青霉素是一类广谱抗生素，对大部分革兰氏阳性菌，一些革兰氏阴性菌、放线菌和螺旋体等都有很强的抗菌作用，在临床上主要治疗肺炎、败血症等疾病。

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