摘 要

目的：本文通过运用DNA 条形码技术对虾脊兰属中不同种植物进行鉴定区分，对保护虾脊兰属药材资源以及使用的安全性和有效性具有重要的意义。

方法：提取已收集的虾脊兰属植物药材的总DNA，PCR扩增ITS2 和psbA-trnH序列并进行测序，使用软件CodonCodeAligner V4. 2 对测序峰图进行校对拼接，并对峰图进行质量控制。应用MEGA 5.1 软件计算种内和种间Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离,基于ITS2和psbA-trnH序列构建邻接（NJ）系统聚类树。

结果：在本设计的样本量下，虾脊兰属植物种内遗传距离为0，虾脊兰属不同种植物K2P 遗传距离分布于0.005-0.940；基于ITS2和psbA-trnH序列的NJ树表明，ITS2和psbA-trnH序列可将虾脊兰属植物中不同种进行区分鉴定。

结论：ITS2和psbA-trnH序列能应用于虾脊兰属中不同种植物的鉴定。

关键词：虾脊兰属；DNA条形码技术；ITS2；psbA-trnH；鉴定

Abstract

Objective: To identify Calanthe R. Br. and secure its quality and safety in medication .

Methods: Total genomic DNA was extracted from Calanthe R. Br. and its adulterants. ITS2 and psbA-trnH sequences were amplified, and purified PCR products were sequenced. Sequence assembly and consensus sequence generation were performed using the CodonCode Aligner V4.2. The Kimura 2-Parameter (K2P) distances were calculated using MEGA 5.1. The neighborjoining (NJ) phylogenetic trees were constructed.

Results: The intraspecific genetic distances of Calanthe R. Br. were 0. The interspecific genetic distances between Calanthe R. Br. and its adulterants were ranged from 0.357 to 0.410. The NJ tree showed that Calanthe R. Br. could differ from its adulterants obviously.

Conclusion:ITS2 and psbA-trnH sequences can be used to identify Calanthe R. Br. from its adulterants effectively.

Key Words：Calanthe R. Br.；DNA barcoding； ITS2 ； psbA-trnH ；identify；

目 录

摘 要 I

Abstract II

第1章 绪论 1

1.1虾脊兰属植物简介 1

1.2研究的目的及意义 1

1.3 DNA条形码技术概况 2

1.3.1DNA条形码技术的简介 2

1.3.2 DNA条形码鉴定原理 3

1.3.3 DNA条形码技术的研究进展 3

1.4研究内容及目标 4

1.4.1研究内容 4

1.4.2研究目标 4

1.4.3技术路线 4

第2章 虾脊兰DNA条形码实验研究 6

2.1 材料 6

2.1.1虾脊兰属药材样本的收集 6

2.1.2 仪器与试剂 7

2.2 实验原理 8

2.2.1 DNA的提取 8

2.2.2 PCR过程 8

2.2.3 测序原理 9

2.3 实验方法 9

2.3.1 常用溶剂配制 9

2.3.2 供试品处理 9

2.3.3 DNA的提取 10

2.3.4 样品DNA 的保存 11

2.3.5 DNA 纯度检测 11

2.3.6 PCR扩增 11

2.3.7 电泳检测及测序 12

2.3.8 紫外检测及测序 13

2.3.9 数据分析 13

2.4 结果与分析 13

2.4.1虾脊兰属植物不同序列种内变异分析 13

2.4.2虾脊兰属植物不同序列种间变异分析 15

2.4.3虾脊兰属植物不同序列种内、种间遗传距离分析 15

2.4.4虾脊兰属植物不同序列的NJ树的建立 16

第3章 结果讨论与展望 20

3.1结果讨论 20

3.2展望 20

随 20

参考文献 22

致 谢 23

第1章 绪论

1.1虾脊兰属植物简介

　　虾脊兰属（Calanthe R. Br.）隶属于兰科，地生草本。根为圆柱形，细长而密被淡灰色绒毛。根状茎有或无。假鳞茎通常比较粗短，圆锥形，很少有不明显的或伸长为圆柱形的。叶片数少，常常较大，少数有狭窄而呈剑形或者带状，幼时席卷，为全缘或者波状，基部缩窄为长柄或近无柄，柄下为鞘，在叶柄与鞘相连接的地方有一个关节或无，有毛或无毛，开花期间通常尚未全部展开或少有全部展开的。花葶为当年生，生于低出叶和叶鞘所形成的假茎上端的叶丛中，或生于茎的基部的侧面，少有去年生和从无叶的茎端发出，直立状态，不分枝，下面具鞘或鳞片状苞片，通常密被毛，少数无毛；总状花序有少数至多数花；花苞小或大，宿存或早落；花通常张开，小到中到大；萼片都相似，离生；花瓣比萼片小；唇瓣比萼片大而短，底部与部分或全部蕊柱翅合生而形成长度不等的管，少有贴生在蕊柱足末端而与蕊柱分离的，有距或无距，有距或无距；唇盘有附属物（胼胝体、褶片或脊突）或无附属物；蕊柱常常粗短，无足或少数有短足，两侧有翅，翅延唇瓣基部延伸或不延伸；蕊喙分裂或不分裂；柱头侧生；花粉团蜡质，共8个，每4个为整个群，近似相等或不相等；花粉团柄明显或不明显，共同附在于1个粘质物上^[1]。

　　全属有大约150种，分布于亚洲热带和亚热带地区、新几内亚岛、澳大利亚、热带非洲和中美洲。我国有大约49种和5变种，主要来源于长江流域和其以南各省区。虾脊兰属植物花的颜色丰满、植物的叶片很宽、姿态优美，在盆栽、切花、园林植物等方面有很好的应用，并拥有极高的观赏价值，药用植物也占了其中的大多部分，如虾脊兰（Calanthe discolor）、剑叶虾脊兰（Calanthe davidii）、钩距虾脊兰（Calanthe graciliflora）等的假鳞茎和根部拥有清热解毒、消肿止痛等功效，主要用于治胃溃疡、慢性肝炎、慢性咽炎、关节损伤、跌打损伤等，虾脊兰C.discolor中包括有靛玉红、靛红等的药用成分，可以促进皮肤血液的循环^[2]。