摘 要

本研究利用DNA条形码技术，对金线莲及其混伪品的ITS2 序列进行分析，实现金线莲快速准确鉴别，实现临床用药安全。将金线莲药材及其混伪品基因组 DNA提取出来，以P3/E4为引物，PCR 扩增 ITS2 序列并进行双向测序。所有序列经过 Codon Code Aligner V3.7.1 拼接后，采用 MEGA7.0软件进行序列比对，计算种间以及种内Kimura2-Parameter（K2P）遗传距离，并构建系统发育树，来进行对金线莲及其混伪品的区分。采用相似性搜索法、邻接（NJ）树法、最近距离法对 ITS2序列鉴定能力进行评估。金线莲的 ITS2 序列长度为 257 bp，无种内变异，其 ITS2 序列种内最大 K2P 遗传距离（0）小于与混伪品的最小种间 K2P 遗传距离（0.004）；基于 ITS2 序列构建 NJ 树，金线莲及其混伪品均表现出良好单系性；应用相似性搜索法可以表明 ITS2 序列能够准确鉴定金线莲及其混伪品，均能明显区别。ITS2序列能够稳定、准确地鉴定金线莲药材及其混伪品，DNA 条形码技术为金线莲药材及其混伪品的鉴定提供新的方法。

关键词：金线莲；ITS2序列；DNA条形码；鉴定

Abstract

In this study, the ITS2 sequence of Anoectochilus and its mixed products was analyzed by DNA barcode technique to realize the rapid and accurate identification of Anoectochilus, and the clinical drug safety was used to extract the genomic DNA of Anoectochilus and its mixed product. The ITS2 sequence was amplified by PCR and primed with P3 / E4 as the primer. All sequences were compared by Codon Code Aligner V3.7.1, and the genetic distance between the species and the Kimura2 parameter (K2P) was calculated by MEGA7.0 software. The phylogenetic tree was constructed to distinct Anoectochilus and its mixed product. The ability of ITS2 sequence identification was evaluated by similarity search method, adjacency (NJ) tree method and nearest distance method. The genetic distance (0) of the ITS2 sequence was less than that of the minimum interspecies K2P genetic distance (0.004) between the ITS2 sequence. The ITS2 sequence was based on the ITS2 sequence. NJ tree, Anoectochilus and its mixed products showed good monophyletic; application of similarity search method can show that ITS2 sequence can accurately identify Anoectochilus and its mixed products, can be significantly different.ITS2 sequence can be stable, The DNA barcode technology provides a new method for the identification of Anoectochilus and its counterfeit products.

Key words: Anoectochilus; ITS2 sequence; DNA barcode; identification

目 录

第1章 绪论 1

1.1 药材简介 1

1.2 研究目的及意义 1

1.3 研究内容及目标 2

1.3.1 研究内容 2

1.3.2 目标 2

1.4 DNA条形码技术 2

1.4.1 DNA条形码技术的概念 2

1.4.2 DNA条形码技术的发展及优势 3

1.4.3 DNA条形码技术的国内外研究现状 3

第2章 药材的DNA条形码实验鉴定研究 5

2.1 实验原理 5

2.1.1 总DNA的提取 5

2.1.2 DNA检测 5

2.1.4 测序原理 6

2.2 实验耗材 7

2.2.1 实验药品及来源 7

2.2.2 仪器与试剂 9

2.3 实验方法 10

2.3.1 供试品处理 10

2.3.2 药品的配置 11

2.3.3 DNA的提取 11

2.3.4 样品DNA的保存 13

2.3.5 PCR扩增 13

2.3.6 琼脂糖凝胶电泳检测 14

2.3.7 测序 14

2.3.8 数据分析 14

2.4 数据分析及处理 15

2.4.1 金线莲及其混伪品种内变异分析 15

2.4.2金线莲与混伪品种间变异分析 16

2.4.3金线莲与混伪品种间序列聚类分析 17

第3章 结论 19

参考文献 20

致谢 22

第1章 绪论

1.1 药材简介

开唇兰属（兰科）是一种多年生草本植物，大约有40多种，主要分布在热带地区。这些物种中，很多已被用作中国民间药物，如金线兰Anoectochilus roxburghii和台湾银线兰Anoectochilus formosanus。金线兰和台湾银线兰是两种有价值的中国民间药物，已经成为中国和其他亚洲国家的受欢迎的保健草药茶。金线兰别名金线莲、金蚕、金石松、树草莲、鸟人参、金线虎头蕉、金线入骨消 ,中文学名是花叶开唇兰。这种草本植物因其多种药理作用和强大的药用功效而被称为“药王”。全草入药，广泛用于治疗糖尿病，癌症，肝脏疾病，心血管疾病，肾炎和毒蛇咬伤等病症。在中国，由于其观赏价值和药用性质，加上金线莲在自然环境生长速度较慢，掠夺性的采集，对生态环境的破坏，以及对金线莲的需求不断增加，导致金线莲药材资源过度开发和枯竭^[1]，金线莲于1990年被福建省省政府列为濒危药用植物。强大的功效、资源稀少使得市场上出现了很多混伪品，其主要的混伪品有血叶兰Ludisia discolor和斑叶兰Goodyera。它们形态相似，都具有网纹而且植株高度都在10-50cm之间，单单依靠传统的形态鉴定难以将其区分开。

金线莲及其混伪品形态对比^[2-4]

1.2 研究目的及意义

传统鉴定生物物种一直依赖于形态特征，中药的鉴别手段主要是显微和性状等传统鉴定技术。然而，表型特征常常受植物变异性和生长栖息地的影响。此外，有些植物形状相似，其形态特征容易混淆。近年来，随着全球经济的飞速发展，中药行业在经济发展中地位的不断提高，对中药鉴定工作量也逐渐加大，而传统鉴定人才却不断缩减，加之传统鉴定方法费时费力，导致医院、企业、药店、海关等各行业鉴定需求不能得到满足，因此亟需一种能够将中药快速准确鉴定的新方法。