1.1 周围神经损伤和组织神经工程系统

随着机械化产业和公共交通的发展，周围神经损伤的案例逐年增多，周围神经损伤的修复的问题亟待解决。目前传统的自体神经与异体神经移植是临床治疗周围神经缺损的常用方案，然而其本身的局限性极大的限制了它们的广泛应用。因此，修复周围神经损伤成为科研工作的难点。

目前，组织神经工程系统兴起为周围神经损伤的修复提供了新的方向。组织神经工程系统主要是利用神经导管(Nerve guidance conduit, NGC）与细胞、因子的协同作用以修复损伤神经。神经导管主要是人工制备的一个直径长度与缺损神经相匹配的管状支架，起到引导神经再生的作用。缺损神经在神经导管上的修复过程主要可以分为三个阶段（见图1.1）:①首先，巨噬细胞迁移进入神经断点，雪旺细胞在神经导管的表面支撑物上迁移和增殖，最终形成Bungner带;②然后，雪旺细胞在增殖的过程中不断产生相应的神经生长因子和细胞外基质;③神经生长因子可以刺激轴突的再生和延长，它是以近侧残端为起点向着远端残端逐渐再生的过程。最后，新的轴突不断延长，直到与远端残端接触，从而实现神经的再生和功能的恢复。

图1.1神经在人工导管上修复的示意图

由此可见，组织神经工程系统中较为核心的是神经导管的构建。本课题通过改变材料组成、结构及各成分含量，构建特定的三维结构的支架从而获得较适宜的力学性质、降解率、孔隙率、渗透率和表面形状，可接纳再生轴突长入，对轴突起机械引导作用，并可以引入神经营养因子和干细胞至导管腔内，形成复合的神经导管，满足不同类型神经损伤的需要。

1.2电刺激信号与导电高分子材料

在神经缺损前期，由于其神经功能恢复有限，往往会导致骨骼肌萎缩，临床上电刺激常常被用来刺激损伤的周围神经，一方面促进周围神经再生，另一方面防治骨骼肌失神经萎缩。同时，由于神经本身就具备电信号传导的作用，给予外界的电刺激能够显著提高神经的再生与恢复。国内外许多实验均证实了电刺激能够促进周围神经修复的作用。尽管电刺激促进神经再生的机制尚且不明确，但是基本可以归纳为以下几点:促进SC细胞的迁移、增殖和发育，促进了SC细胞分泌大量的NGF因子达到促进轴突延伸的作用；电场的作用可以对轴突中的微管蛋白、微丝蛋白有趋化导向作用，这提高了神经再生的速率;电刺激亦可能促进毛细血管再生，进而促进周围神经再生。关于电刺激的研究通常会伴随着导电神经导管支架的研究，本课题将导电高分子材料与生物活性材料相结合制备导电神经导管支架，并结合电刺激应用于神经组织工程上。

导电高分子材料，作为一种新型的有机材料，在20世纪70年代被首次合成成功。研究报道指出，电刺激可以促进细胞在导电材料表面更好的增殖与分化，从而促进组织的再生与修复，这包括神经、骨骼、心脏和肌肉组织等。其中，由于神经本身对电信号较为敏感，导电材料可应用于神经修复。

目前，新型的具备导电性生物材料主要包括碳纳米管、氧化石墨烯、聚苯胺（PANI）,聚毗咯(Ppy)和聚(3, 4-乙烯二氧噻吩)（PEDOT）。Yu等在研究中，利用多壁碳纳米管(MWNTs)与生物活性材料复合制备神经导管支架，体外实验表明MWNTs的加入促进了SC细胞在支架表面的粘附和延伸，体内实验表明该导电神经导管支架能够显著地促进神经再生和防止肌肉失神经萎缩。Baniasadi等将石墨烯与聚毗咯混合制备得到导电性神经导管支架，结果表明该支架具有较好的电导率、杨氏模量和生物相容性，并指出该支架具有促进神经修复的应用潜力。大量的结果表明导电材料在神经修复的领域有着很好的应用前景，因此，本课题拟对多种导电生物材料进行制备和表征,选择性能最佳的一种或多种材料，将生物电材料应用于神经导管中并完成生物电材料掺杂的神经导管的表征，用于构建神经导管复合组织工程系统。

2.1 研究（设计)的基本内容

本课题拟对多种导电生物材料进行制备和表征,选择性能最佳的一种或多种材料，将生物电材料应用于神经导管中并完成生物电材料掺杂的神经导管的表征，用于构建神经导管复合组织工程系统。

2.2 研究（设计）的目标

1.不同生物导电材料的制备、表征和筛选；

2.将生物电材料应用于神经导管中；

3.生物电材料掺杂的神经导管的表征。

2.3 拟采用的技术方案及措施

2.3.1 氧化石墨烯制备

取1.0g天然石墨粉，0.5g硝酸钠于三口烧瓶中，在冰浴条件下缓慢加入23ml浓硫酸，持续搅拌15min。再缓慢加入4g高锰酸钾并保持系统温度不超过20℃，继续搅拌2h。移除冰浴将系统加热到35度，持续搅拌1.5h。缓慢加入46ml去离子水，维持体系温度98度，剧烈搅拌30min。然后在空气中冷却，加入140ml去离子水和10ml双氧水去终止反应，悬浮液变亮黄色。离心洗涤，用5%HCl和去离子水充分洗涤之PH接近中性，冷冻干燥得到棕色固体氧化石墨烯。将得到的固体分散到去离子水中（1mg/ml）。超声剥离，得到氧化石墨烯（GO）纳米片，离心30min（10000r/pm）除去未剥离氧化石墨，最后获得棕色GO悬浮液，冷冻干燥得到GO固体。

2.3.2 聚吡咯制备

称取1ｍＬ吡咯溶于100ｍＬ乙醇水溶液（体积比1∶1 ）中，冰浴下搅拌至完全溶解，逐滴加入20ｍＬ过硫酸铵溶液（含３.2ｇ过硫酸铵），反应24ｈ，抽滤，用乙醇、水洗涤，真空50℃干燥24ｈ，即得聚吡咯（Ppy）。

2.3.3碳纳米管的制备

用竖式炉流动法，以二茂铁为催化剂，硫为助催化剂，苯为碳源制备碳纳米管，反应温度为1100-2000℃, 用透射电子显微镜研究碳纳米管的微观结构。

2.3.4聚苯胺的制备

用乳液聚合的方法，将重蒸后的苯胺、SDS(或CTMAB、PEG)和0.1 mol／L的HCl加入三口烧瓶中混合，搅拌1 h；将一定量过硫酸铵溶解在0.1 mol／L的HCl溶液中，然后缓慢滴加到上述溶液中，边滴加边搅拌。控制苯胺、引发剂、分散剂的物质的量之比为l:1:1(或1:1:0.5)，反应温度控制25℃，时间持续12 h后，加入丙酮破乳，用乙醇将沉淀物清洗后，再用蒸馏水继续清洗，直到上层清液pH在6以上。收集沉淀物，60℃下真空干燥24 h，得到聚苯胺（PANI）。

2.3.5.聚(3,4-乙烯二氧噻吩)的制备

通过化学氧化聚合的方法，分别在表面活性剂水溶液和反向胶束中制备聚(3, 4-乙烯二氧噻吩)（PEDOT）纳米棒。在表面活性剂的水溶液中，SDS作为表面活性剂，水和甲醇作为反应溶剂，FeCl3作为氧化剂。制备过程如下:首先将10 mL甲醇和70 mL水混合均匀，接着将0.209 g SDS分散在上述溶液中并在50℃的恒温水浴中搅拌1h;然后将0.9732 g FeCl3加入到上述溶液中继续搅拌3 h，使溶液中形成微胶束;最后将200g/L的EDOT逐滴滴加到微胶束溶液中，并在恒温水浴中继续反应8h。待反应结束后，将产物用孔径为0.22 gm的有机滤膜进行抽滤分离，并用水和乙醇反复清洗，最后将产物收集并置于60℃的真空干燥箱中干燥24 h。在反向胶束中，AOT作为表面活性剂，正己烷作为反应溶剂，FeCl3作为氧化剂。制备过程如下:首先将3.02 g AOT溶解在20mL的正己烷中，接着将0.54mL, 7 mol/L的FeCl3:水溶液逐滴加入到上述溶液中，然后将混合溶液在50℃的恒温水浴中搅拌4 h;最后将100g/L的EDOT逐滴滴加到反向胶束中，并在20℃恒温水浴中继续反应8h。待反应结束后，将产物抽滤分离，并用水和乙醇反复清洗，最后将产物收集并置于60℃的真空干燥箱中干燥24 h。

2.3.6支架导管的构建

利用静电纺丝技术，用以上五种材料构建内径5mm的支架导管。

2.3.7支架导管形貌的观察

将真空干燥一周后的样品每组随机取3个，用导电胶将10 mm×10mm大小的纤维膜固定于载物台，并对其表面进行喷金处理（厚度：10 nm-30 nm），在各放大倍数下用扫描电子显微镜（SEM）对纤维膜表面进行高分辨率的形貌观察，可以反映出纤维膜的不同表面形貌（珠串结构、带状结构和粗糙表面）。原子力学显微镜（AFM，Bruker，USA）在tapping模式下扫描GO-云母片表面形貌，获得GO的厚度以及尺寸分布等信息。将超声分散的GO水溶液滴到云母片上，自然风干，制备AFM样品。透射电镜（TEM）观察：每组各取3个样品，将铜网用医用双面胶贴在接收板上，直接将纺丝膜接收在铜网上用于检测。

2.3.8导管材料的孔隙率测定

本实验采用比重法测定孔隙率（Porosity）。将装满乙醇后的比重瓶称重记为M1，并将该纤维膜样品称重记为 M0，之后将样品置入装满乙醇的密封容器中静置，待乙醇完全充盈于纤维膜的孔隙后，再向比重瓶中添加乙醇，对此时比重瓶称重并记为 M2，把浸满乙醇的纤维膜取出，称量剩余比重瓶与乙醇的质量为M3，每个样品平行测定 5 次，取平均值。

2.3.9力学性能的测定

将真空干燥后的纤维膜裁成（长：50 mm，宽：10 mm）的长方条形状，用螺旋测微仪测量出纤维膜的厚度，放置在微机控制电子万能试验机的两个夹板间，室温下，用50 N的力学传感器，夹头间距：10 mm，加载速度：0.5 mm/min，记录初始负荷及位移。逐渐增加负荷，并记录相应的负荷及位移。按实验施加的负荷及纤维膜尺寸，计算出相应的应力值，从负荷变形曲线中可得应力-应变曲线。每个有效样品平行测定5次，取平均值。

2.3.10电导率的测定

对样品进行电导率的测定，取适量的组织支架，在一定条件下制成规格的圆形试样片；将复合支架用打孔器将复合物制成一定规格的圆柱状，均采用KDY-1四探针测试仪测定样品的电导率。

2.3.10复合神经导管的构建与表征

根据以上制备过程及表征结果，选择制备最简易、性能最佳的导电生物材料，构建导电材料/聚乳酸复合神经导管，并对其进行上述表征。

第1-2周 查阅文献，进行文献调研，完成开题报告

第3-10周 制备多种导电生物材料神经导管并进行表征

第11-12周 合成最佳材料复合神经导管并表征

第13-14周 撰写毕业论文

第15周 准备毕业答辩

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