文 献 综 述

1、 细胞固定化的机理及方法

1.1、细胞固定化的机理

固定化细胞是指固定在水不溶性载体上，在一定的空间范围进行生命活动（生长、繁殖和新陈代谢等）的细胞。它是用于获得细胞的酶和代谢产物的一种方法，起源于20世纪70年代，是在固定化酶的基础上发展起来的新技术^[1]。由于固定化细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，所以又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。通过各种方法将细胞和水不溶性载体结合，制备固定化细胞的过程称为细胞固定化

1.2、细胞固定化的方法

1.2.1、吸附法

很多细胞都有吸附到固体物质表面,或其他细胞表面的能力, 吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法,前者是使用具有高度吸附能力的硅胶^[2]、活性炭、多孔玻璃、沸石，石英砂和纤维素等吸附剂将细胞吸附到表面上使之固定化。后者根据细胞在解离状态下可因静电引力而固着于带有相异电荷的离子交换剂上。用木屑吸附细胞装填的固定化反应器来生产乙酸，是最早应用固定化细胞过程之一。吸附法的过程技术要求简单，成本低，载体可再生重复利用，空间位阻小，反应过程温和，但是牢固性较差，当外界环境发生突变时，易造成微生物（酶）从载体上脱落。固定化细胞（酶）的结合量以及生物活性收到载体种类的影响较大。在这类系统中，细胞与溶液之间没有屏障，因此不能用于要求出口料液不含游离细胞的场合。

1.2.2、共价结合法

共价结合法是细胞表面上官能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接实现细胞固定化的方法。采用共价结合法固定的微生物与固相载体的结合力较强，但是因为固定过程中反应激烈，操作较复杂，因而对微生物活性存在较大抑制，普遍应用性较差。

1.2.3、交联法

交联法与共价结合法类似, 利用载体表面两个或者两个以上官能团与细胞之间发生分子间的交连使细胞固定化,但交联法所采用的载体是非水溶性的，交联剂多采用戊二醛、双重氮联苯胺等^[3]。交联法固定的细胞与载体联结牢固，稳定性高，但是交联过程生化反应复杂，反应激烈，抑制了微生物的活性，适用范围较狭窄。

1.2.4、包埋法

包埋法是细胞固定化最常用的方法。按照包埋系数的结构可分为凝胶包埋和微胶囊法,即将细胞包裹于凝胶的微小格子内或半透膜聚合物的超滤膜内^[4], 该方法成本低，操作简单, 对细胞活性影响较小, 制作的固定化细胞球的强度较高。但传质阻力较大。

包埋法有较好的综合性能^[5-6]，催化活性保留和存活力都比较高，且包埋在反应工程（包括反应器的设计、操作稳定性等）中应用灵活，因此，包埋法成为整个固定化生物催化剂技术中应用最广泛的固定化方法；但是包埋法的扩散阻力较大，使细胞的催化活性受到限制，较适合于小分子底物与产物的反应。

2、 酿酒酵母

酿酒酵母^[7]又称面包酵母或者出芽酵母。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，不仅因为传统上它用于制作面包和馒头等食品及酿酒，在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物，其作用相当于原核的模式生物大肠杆菌。

2.1酿酒酵母的结构

酿酒酵母^[8]的结构与大多数真核生物相同，有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、核糖体、线粒体、液泡和内质网组成。其形状为球形或者卵形，直径5#8211;10μm，长4.5～21.0μm。图2-1为电子显微镜下的酿酒酵母细胞结构示意图。

图2-1 电子显微镜下的酿酒酵母细胞结构示意图。

2.2 酿酒酵母的性质

酿酒酵母一般不产生假菌丝，只在玉米粉琼脂上形成。在厌氧条件下能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖或半乳糖产生乙醇和二氧化碳。通常以芽殖方式进行无性繁殖。有性繁殖形成子囊孢子^[9-11]。当双倍体营养细胞增大在以乙酸盐作主要或惟一碳源，同时氮源不足的培养基上时，易形成子囊孢子。放线菌酮（100mg/L）可抑制生长。

2.3 酿酒酵母的应用

酿酒酵母是著名的工业菌种，广泛用于酿酒、发面，生产酒精、甘油、酵母单细胞蛋白，以及用于提取核酸、麦角甾醇^[12-13]、辅酶A、辅酶I、细胞色素C、凝血质和ATP等生化药物。因其富含蛋白质、酶类和维生素等，故可供药用、食用和饲料用。有的用于饲料发酵。近年来，广泛用作遗传工程中的优良受体菌，用于生产干扰素等多种多肽类药物。广泛分布于水果、蔬菜表面以及果汁、酒曲和果园土中。

3单细胞固定化

研究发现，与游离状态相比，酵母、细菌、动物细胞等细胞被固定在适当载体上后，其酶活性和细胞生存能力能够得到大大加强^[14]。因此，固定化细胞已被广泛运用于微生物发酵^[15]、全细胞催化^[16]等多个领域。但是，目前的研究多集中于多细胞固定化领域，而关于单细胞固定化的研究较少。Wang和Bodovitz ^[17]曾指出，单细胞分析已成为组学研究的最新瓶颈。由于细胞的异质性，各种细胞生物学功能包括生长、代谢、基因表达和信号交流等在不同的单个细胞之间也是不同的。通过分析单个细胞之间的不同，不仅可以深入研究细胞内基因和蛋白质水平上的具体变化过程，而且能够在临床医学上的癌症等疾病诊断上发挥极其重要的作用。然而，单细胞的分析研究需要先进的技术手段作为支撑。单细胞个体小巧，难以扑捉，难以单个分析。若能将单个细胞加以固定化，不仅能够增大细胞的体积，根据需要嫁接上易于识别的标记，还能增强细胞的生存能力和细胞内酶的活性^[18]。

目前，关于单细胞的固定化方法大体可以分为两类：生物矿化法和微流控包裹法。韩国分子水平界面研究中心教授Yang Sung Ho研究团队采用两种高分子化合物运用LBL方法将单个微生物细胞包裹起来，在微囊外再进行硅化处理，不仅可以增强微生物细胞的生存时间^[18-19]，而且能够在表面进行荧光处理^[19]。龚莹莹^[20]将液滴微流控芯片用于酶活力的测定和细胞的包裹，发现当细胞浓度为2.5#215;10⁶/ml时，每个液滴内仅含一个细胞的概率是最大的，并且其细胞包裹率也是最大的。Chabert和Viovy^[21]也采用微流控法对单细胞进行包裹和hydrodynamic筛选。

4酿酒酵母单细胞固定化

酿酒酵母是目前研究背景最为清楚的单细胞真核生物，是典型的真核生物。本课题拟以酿酒酵母细胞为例，将其进行单细胞固定化，初步研究单细胞固定化后对酿酒酵母的生存能力、机械性能、膜渗透性能等的影响，为真核微生物的单细胞固定化研究提供参考。

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基本内容：

本课题拟以天然高分子材料壳聚糖和海藻酸钠通过层层自组装将酿酒酵母单细胞固定化，并在其表面进行仿生硅化，研究单细胞固定化后酵母细胞的活性周期、膜渗透性、机械性能等方面的变化。

拟解决的关键问题：

1层层自组装法固定化酿酒酵母单细胞

2生物矿化法修饰固定化酿酒酵母单细胞

3固定化酵母单细胞的表征

2 研究的方法与技术路线

工艺路线如流程图:

酿酒酵母单细胞固定化工艺流程图