摘 要

非编码RNA是指生命体中没有编码蛋白质功能的所有RNA，研究表明非编码RNA在生命体中存在大量的的种类与数量，其结构的多样性决定了其功能的多样性，它参与了生命体的各项活动，起到了重要的干扰，调控等作用。要想深入研究非编码RNA的结构特征以及在生命活动过程中的作用机理，就需要有成熟的大量制备RNA样品的方法。RNA的固相合成是指是以单核苷酸为原料，以特定介质为载体，采用有机合成反应按照碱基序列逐步拼接最终获得目标核酸分子的过程，利用这一方法，我们可以方便快捷地大量合所需的RNA样品。根据固相合成的特点，我们还可以做到对RNA分子的定点标记，为探针的标记实验提供便利。本文主要研究了固相合成的基本原理，用于实验的单体的结构特征，以及脱保护的方法，并且合成了目标RNA分子，探索了其纯化和鉴定的条件和方法。结果表明，固相合成能以较高的反应效率合成大量的RNA分子，最终产品的纯度和活性均符合要求。

关键词：非编码RNA；定点标记；固相合成；脱保护

Abstract

Non-coding RNA refers to all RNAs in the living body that do not have the function of encoding proteins. Studies have shown that non-coding RNAs have a large number of species and numbers in the living organisms,and their structural diversity determines the diversity of their functions. It played an important role in interference,regulation and control. In order to study the structural characteristics of non-coding RNA and the mechanism of action in the process of life activities,there is a need for a mature method for preparing large amounts of RNA samples. The solid phase synthesis of RNA refers to the process of using single nucleotide as the raw material and using the specific medium as the carrier to obtain the target nucleic acid molecule in the order of the base sequence. By this method,we can quickly and easily make large number of RNA samples. According to the characteristics of solid-phase synthesis,we can also do the labeling of RNA molecules,witch can facilitate the next experiment. In this paper,the basic principles of solid phase synthesis,the structural characteristics of the monomers used for the experiment,and the deprotection method were studied. The target RNA molecules were synthesized and the conditions and methods of purification and identification were explored. The results show that solid phase synthesis can synthesize a large number of RNA molecules with high reaction efficiency,and the purity and activity of the final product also meet the requirements.

Key Words： Noncoding RNA; Fixed-point mark;Solid phase synthesis; Deprotection

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1非编码RNA概述 1

1.2非编码RNA的结构特点 1

1.3 RNA的常用制备方法 3

1.4 本课题预期目标、实验内容及研究意义 3

第二章 RNA的固相合成以及纯化 4

2.1合成基本原理 4

2.2固相载体 6

2.3单体核苷酸 7

2.4合成的四个基本步骤 10

2.4.1活化 10

2.4.2耦合 11

2.4.3盖帽 12

2.4.4氧化 13

2.5脱保护 13

2.6纯化方式 14

2.6.1凝胶电泳法 14

2.6.2Whatman Elutrap电洗脱系统 15

第三章 实验部分 17

3.1 RNA样品制备 17

3.1.1实验试剂 17

3.1.2实验仪器 17

3.1.3实验操作 17

3.2 RNA的纯化和鉴定 18

第四章 结论与展望 19

4.1 结论 19

4.2 展望 20

参考文献 21

致 谢 23

第一章 绪论

1.1非编码RNA概述

从核糖核酸的发现至今已经有了一百多年的历史，人们对于核糖核酸（RNA）的认识从无到有已经有了前所未有的突破。现如今我们已经知道，细胞生物以及部分病毒内都有RNA作为遗传载体。中心法则告诉我们，蛋白质的表达是通过从DNA到RNA再到蛋白质的一个过程。在较长的一段时间内，人们对于RNA的认识局限于此，认为在人类的生长发育各方面起到主要作用的是蛋白质，除了辅助mRNA成熟（sn-RNA）和蛋白质的翻译外，大部分的RNA知识DNA和蛋白质之间的桥梁^[1]。

RNA在生命活动中扮演着极其重要的作用，前人研究发现RNA不仅能作为遗传信息携带者，还可以作为功能分子，如核酶的发现等。我们把能表达蛋白的那一部分称为编码RNA，将不能表达出蛋白的称为非编码RNA。脊椎动物基因组序列的研究证据表明，在演化上保留下来的非编码区域远远超过编码区域，而且这些基因组序列区域多数与基因调控有关。如人类基因组中也只有2%是编码RNA，有超过80%的基因也转录，只是产物是不表达蛋白的非编码RNA，它们在人体各项生命活动的调节中扮演着必不可少的角色。细胞作为生物结构和功能的基本单位，其代谢过程、遗传信息传递等生理活动必定是受到高度调控的，其中非编码RNA就起着重要作用^[2-5]。从简单的单细胞生物到复杂的哺乳动物之间编码区基因数目差别并不大，有些哺乳动物的基因与人类基因相似程度甚至高达99%。但之所以不同生物之间有着差异如此巨大的表现型，就是因为这些非编码RNA在生命调控中起着十分重要的作用。其通过影响染色体结构，调控DNA的转录和翻译以及DNA的甲基化，参与RNA的加工修饰和稳定，调控蛋白质等方式来完成对生物体生长发育的调控，甚至在癌症的发展中也起到关键的作用^[6-7]。进一步研究非编码RNA在生命调控功能中的功能、动态变化及调控机制，将有助于发现新的生物指标和靶向治疗位点，为疾病的预防、诊断和治疗等提供思路^[8-9]。

1.2非编码RNA的结构特点

我们都知道，结构决定功能。非编码RNA的结构决定着它在生命活动中能起到什么样的作用。蛋白质在生命活动中发挥作用也是靠它特定的结构特征，与蛋白质一样，RNA同样具有一级，二级，三级结构。只有RNA正确折叠，才真正具有生理活性^[10-12]。近年来非编码RNA呗科学家越来越重视，研究也越来越火热。大量研究人员通过不同的实验方法解析RNA的折叠方式，结构特征和动力学特征等^[13-15]。已经取得了一定的进展。然而截至目前，受限于研究手段的极度匮乏，加上RNA本身不稳定易降解，研究难度大，非编码RNA的结构研究仍然进展缓慢。已知的非编码RNA的结构以及其相应的调节机制少之又少。

从分子结构来看，磷酸基团，五碳糖，含氮碱基是组成核酸的基本基团。与脱氧核糖核酸不同的是，RNA在核苷酸五碳糖的2’端带有羟基基团，其基本骨架和DNA相似也是通过磷酸二酯键连接得到。RNA也有四种不同的碱基类型，分别为胞嘧啶（Cytosine，简称C），尿嘧啶（Uracil，简称U），腺嘌呤（Adenine，简称A）和鸟嘌呤（Guanine，简称G）。如图1.1所示是这四个碱基的结构图，其中碱基U只存在于RNA分子，而碱基T只存在于在DNA分子中。根据核苷酸结构，有很多位点是可以修饰的，修饰的基团不同，RNA的结构功能自会不同^[16-19]。在生物体中，修饰的RNA分子的种类和数量远远多于DNA分子。