摘 要

目的：开发并验证一种基于液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）的分析方法，以求达到快速、灵敏地测定Mito Q孵育前后培养基和线粒体中Mito Q含量变化，研究Mito Q在体外细胞的摄取行为。方法：采用LC-MS/MS技术，睾酮-D3作为内标，测定加药孵育后不同时间点细胞培养基和线粒体中Mito Q浓度。结果：该方法专属性较高，0.1-1000nmol/L范围内线性关系良好，满足精确度和准确度要求，提取回收率高，无明显的基质效应，且样品稳定，未见明显降解，该方法可运用于Mito Q的体外支持细胞摄取研究。结论：本实验建立的测定培养基和线粒体中Mito Q浓度的LC-MS/MS方法可成功应用于Mito Q在体外支持细胞摄取研究，Mito Q在支持细胞线粒体吸收是线性的过程。

关键词：Mito Q LC-MS/MS 细胞摄取

Abstract

Objective: To develop and validate an analytical method based on liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry (LC-MS/MS) for rapid and sensitive determination of Mito Q content in culture medium and mitochondria before and after incubation, and to study the uptake behavior of Mito Q in vitro cells. METHODS: LC-MS/MS technique and Testosterone-D3 were used as internal standards to determine the concentration of Mito Q in cell culture medium and mitochondria at different time points after drug incubation. Results: The method has high specificity and good linearity in the range of 0.1-1000 nmol/L,meets the requirements of accuracy and accuracy, high extraction recovery, no obvious matrix effect, stable sample and no obvious degradation. In vitro support cell uptake studies that can be applied to Mito Q. Conclusion: The LC-MS/MS method for determining the concentration of Mito Q in the assay medium and mitochondria can be successfully applied to the in vitro support cell uptake study of Mito Q. Mito Q has significant mitochondrial targeting distribution characteristics.

Keywords: Mito Q;LC-MS/MS; Cellular uptake

目 录

摘要 Ⅰ

Abstract Ⅱ

第一章 文献综述 1

1.1线粒体靶向抗氧化剂Mito Q概述 1

1.2 LC-MS/MS在生物样品检测应用概述 2

1.3细胞摄取实验概述 3

1.4研究思路 3

第二章 Mito Q在培养基和支持细胞线粒体中的分析方法及方法学验证 5

2.1实验材料 4

2.2实验方法 5

2.2.1 支持细胞培养 5

2.2.2 细胞摄取实验 5

2.2.3 样品预处理 6

2.2.4色谱和质谱条件 6

2.2.5溶液配制 7

2.2.6培养基和线粒体中Mito Q的药物浓度-时间曲线绘制 8

2.3 LC-MS/MS方法学验证 8

2.3.1特异性考察 8

2.3.2标准曲线及定量下限的测定 8

2.3.3精密度与准确度 8

2.3.4提取回收率与基质效应 9

2.3.5样品稳定性实验 9

第三章 实验结果 10

3.1特异性考察实验结果 10

3.2标准曲线的制备及定量下限的测定结果 12

3.3精密度与准确度实验结果 12

3.4提取回收率与基质效应实验结果 12

3.5样品稳定性实验结果 13

3.6 Mito Q在培养基中和线粒体中药物浓度随时间变化情况 14

第四章 实验结论 16

参考文献 17

致谢 20

第一章 文献综述

1.1 线粒体靶向抗氧化剂Mito Q概述

Mito Q(mitoquinone)是一种泛癸利酮合成类似物，通过一个十碳脂肪链的共价连接将三苯基磷阳离子(TPP )与辅酶Q10结合起来，具有泛醌的结构^[1]。辅酶Q10是细胞呼吸链的组成部分，作为递氢体参与电子传递，对于细胞合成ATP来说是必不可少的成分。近年来的研究表明，辅酶Q10作为一种强大的抗氧化剂，可以减轻氧化应激反应，有效改善线粒体生理功能，同时还具有穿越屏障系统（血脑、血睾屏障）的能力。众所周知，线粒体内包含有众多氧化还原酶，它们在氧化应激条件下催化产生活性氧（ROS）,进而造成低效率的氧化磷酸化^[2]。并且已知的活性氧如脂质过氧化物，羟基自由基，和超氧化物自由基，大量存在则会诱导线粒体损伤。氧化应激是造成线粒体功能障碍的主要原因之一，对于氧化应激，特别是线粒体中活性氧的生成，则被认为是细胞凋亡的诱因，调节众多下游信号通路，因此线粒体是细胞凋亡的关键调节因子^[3]。但是基于线粒体的结构和功能，线粒体具有双层膜结构，并且在进行氧化磷酸化生成ATP时，会造成线粒体膜外存在正电位，这样使得外源性的辅酶Q10难以穿过线粒体膜结构而发挥的抗氧化作用。而Mito Q作为一种新型的线粒体靶向抗氧化剂，其携带的三苯基磷阳离子使得整个分子带上正电荷，可以轻松地顺线粒体膜的电压梯度，穿越线粒体膜后发挥其抗氧化作用。之后其本身的泛醌结构可被呼吸链还原为泛醇，发挥其还原力，对抗线粒体内的自由基和超氧化物^［4-8］。基于Mito Q强大的抗氧化能力，其药理学作用主要体现在以下几个方面：①心力衰竭时的线粒体功能障碍^[9]②糖尿病肾病^[10]③逆转肠道缺血再灌注损伤，结肠炎^[11-12]④酒精性肝病^[13]⑤神经退行性疾病，包括帕金森病(PD)和阿尔茨海默症(AD)，并提示其可以透过血脑屏障发挥作用^[14-15]。⑥细胞损伤后的保护^[16]。另外，Mito Q的抗肿瘤效应，脓毒症保护效应以及治疗代谢综合征和多发性硬化症(MS)也有相关报道^[17-20]。

1.2 LC-MS/MS在生物样品检测应用概述

液相色谱-串联质谱联用技术（LC-MS/MS）是液相色谱和质谱两种现代分析仪器的强强联合的产物。液相色谱的分离原理是基于不同物质在流动相和固定相间持续的吸附和脱附能力的差异。色谱技术不断发展，通过改进固定相的类型和开发新型的物质与固定相的键合方式，出现了诸如排阻色谱、正相和反相色谱、离子对色谱、超高液相色谱等新型色谱，实现色谱技术高速、高效、高灵敏度。单份样品分析十分钟左右即可完成，并且可以实现成批样品的自动连续进样，液相色谱与紫外检测器连接可以最低检测到ng量级。单个的质谱可以对物质进行定性分析，其原理为将待测物质经离子源轰击后再经电磁场的筛选，将不同物质的碎片离子收集并进行分析，进而确定物质的结构实现定性分析。而LC-MS技术（液质联用），将液相色谱的定量能力和质谱的高灵敏的定性能力结合，实现了较好的分析效果。之后出现的LC-MS/MS技术，其特色在于串联质谱仪(andem mass spectrometry，MS/MS)的使用，生物样品分析中常采用的是三重四级杆质谱仪(triple stage quadrupole，TSQ)。在LC-MS/MS技术中，LC-MS/MS技术先以液相色谱为分离手段，各组分经色谱分离后，流出液经离子源，离子化后，通过气帘气后进入质谱，第一重质谱分离出母离子，母离子在经第二重质谱碰撞活化、碎裂，生成子离子，随后子离子在第三重质谱中进行分离，通过选择比对不同母离子和子离子的定量分析效果，确定一对离子对应用于定量。离子对的监测过程有赖于选择反应监测(SRM)和多重反应监测(MRM)技术。选择反应监测指选择性地监测一对确定的离子对，可以极大降低了背景干扰，实现质谱图高信噪比。多重反应监指同时监测多对离子对，实现同时针对多种物质的定量分析，大幅提高了分析效率。由于生物基质中内源性物质种类复杂，样品个体差异大，待测物质浓度可能非常小，建立高效可靠的适用于生物样品的分析方法具有重要意义。而LC-MS/MS技术很好的满足了以上分析要求，不仅继承了色谱分离高效，准确的优点，而且利用了串联质谱强大的定性能力，生物样品内多种微量物质的分离、鉴定已成为一个连续过程，样品分析时间缩短，并且其可应用于热不稳定和不挥发物质物质和生物分子物质（寡聚糖、蛋白质、核酸），不需要使分析物之间实现完全的色谱分离，即可完成定量，并且对于大部分物质定量基本可以达到ng量级，甚至是pg量级，这些优势充分体现在可以对大批量的生物样品中的一种或多种药物或代谢产物进行定性定量分析^[21-24]。因为LC-MS/MS技术对多种类型的生物样品都可以进行检测，而且准确度高，灵敏度良好，所以其已经成为了药物代谢动力学研究的有力工具 ^[25-29]。

1.3细胞摄取实验概述

细胞对药物的摄取途径有三种，一是被动运输，二是主动运输，三是胞吞。药物以何种方式被细胞摄取，与药物的性质和细胞膜性质有关。细胞摄取实验必然离不开细胞培养，培养的细胞长到一定数量后，换成不同浓度的加药培养基孵育一定的时间后，进行细胞破碎，制得细胞样品待测。细胞内药物浓度的测定有赖于建立荧光造影，HPLC-荧光检测器，LC-MS/MS等分析方法。药物摄取实验通过分析细胞内或培养基中药物浓度随时间怎样变化，不同情况下（温度，PH，各种蛋白抑制剂作用下）细胞内药物浓度的变化，进而确定影响药物摄取的因素和药物可能的摄取途径。

在哺乳动物的睾丸中，血睾屏障（BTB）由睾丸支持细胞（Sertoli Cell），支持细胞间的紧密连接（tight junctions,TJS）和支持细胞缝隙连接（gap junction,GJS），基部外胞质特异结构（basal ectoplasmic specializations）和基底膜附近的桥粒构成，它们一起为保护生殖细胞免受有毒物质损害提供了屏障^[30]。以前的研究表明，睾丸支持细胞很容易受到外部有毒物质影响，如双酚A（BPA），雷公藤内酯（TP）和金纳米粒^[31-33]，导致细胞在氧化应激环境，睾丸支持细胞中线粒体损伤和活性氧（ROS）产生，进而导致BTB和睾丸支持细胞的破坏，最终导致精子发生功能障碍。因此，寻找一种线粒体靶向药物，改善睾丸支持细胞氧化应激环境，治疗与睾丸支持细胞线粒体损伤有关的睾丸损伤，仍然具有现实意义。