多肽AP25溶剂残留研究

多肽类化合物广泛存在于自然界中，其中大多数具有一定的生物活性，随着分离技术和结构鉴定等研究方法的飞速发展，越来越多的具有某种生物活性及药用价值的天然多肽类化合物被分离鉴定出来。人们已从动物活性成分中发现了许多具有较强生物活性的多肽，生命活动中的细胞分化、免疫防御、肿瘤病变、抗衰防老、生殖控制、生物钟节律等均与活性多肽密切相关，一些活性多肽为疗效显著的临床药物，如胰岛素、脑活素、生长激素释放抑制素、多肽疫苗川等。因此，对多肽类化合物的研究不仅在理论上而且在实际上也具有重要的意义。

多肽的合成主要有两条途径:化学合成和生物合成。化学合成主要通过氨基酸缩合反应来实现。为得到具有特定顺序的合成多肽, 当合成原料中含有官能度大于 2 的氨基酸单体时, 应将不需要反应的基团暂时保护起来, 然后再进行连接反应, 以保证合成的定向进行。

多肽的化学合成有固相合成和液相合成之分,其主要的区别在于是否使用固相载体。多肽液相合成主要有逐步合成和片段组合两种策略,逐步合成简洁迅速,被用于各种生物活性多肽片段的合成;片段组合法为合成含100个以上氨基酸的多肽提供了最有前途的路线,并已成功地合成了多种有生物活性的多肽,其最大的特点是易于纯制。1963 年, Merrifield 创立了固相合成法,将氨基酸的C 末端固定在不溶树脂上,然后在此树脂上依次缩合氨基酸、 延长肽链。固相合成法又可分为Boc(叔丁氧羰基)法和Fmoc ( 9-芴甲基氧羰基) 法。在传统液相和固相合成多肽方法的基础上,人们又发展了氨基酸的羧内酸酐( NCA)法、 液相分段合成法、 组合化学法等。在生物合成多肽方面,除了常用的发酵法、 酶解法外,随着生物工程技术的发展, DNA 重组技术也被应用于合成多肽。

残留溶剂是药物在生产过程中用到且未能完全出去的有机溶剂。由于残留溶剂无任何疗效，所以必须尽可能地除去以满足临床安全的要求。药物残留溶剂的检查对于控制药品质量，保证用药安全非常重要，并对药品生产企业进行工艺改进起到指导作用。

二十世纪90年代,国外药典以及政府工业卫生会议报告都提出控制要求，1990年,美国药典第22版第三补充本开始收载/有机挥发性杂质0的测试项目，列出6种有机残留溶剂的限度,规定了2种气相色谱分析方法和包衣片测定二氯甲烷残留量的方法，美国药典第23版正式将其列入附录中"欧洲药典规定12种溶剂须限量控制,日本考虑将30种有机溶剂限量列入日本药局方"中国药典从1995年版开始,正式包括/有机溶剂残留测定0,列出7种有机溶剂须限制残留量。1998年CIH第四次会议规定了69种应该检查的残留溶剂。

生物制品在制造过程中为了脱毒、灭活、防止细菌污染，常加入苯酚、甲醛、硫柳汞等试剂作为防腐剂，由于防腐剂本身的毒性，因此决定其在生物制品中使用时应尽量采用最低有效而安全的浓度，各国药典及ICH均对制剂中防腐剂的含量控制做了规定，ICH明确提出了应制定防腐剂含量测定方法。

对于本课题中需要检查研究的有机溶剂和防腐剂等，经查阅相关文献，其物理、化学性质列表如下：

有机溶剂残留量的测定方法为气相色谱法,氢火焰离子化检测器(FID),采用填充柱,以二乙烯苯一乙基乙烯苯型高分子多孔小球为固定相,进样方式为溶液直接进样或顶空进样,以内标法测定时,内标物与待测物的2个色谱峰的分离度应大于1.5,每个标准溶液进样5次,所得待测物与内标物峰面积之比的相对标准差应不大于5%;若以外标法测定时,所得待测物峰面积的相对标准差不大于10%。

本实验主要建立乙腈、二氯甲烷、甲醇、乙酸、乙醚、三氟乙酸、哌啶、1,2-乙二硫醇、苯甲硫醚、苯酚、N,N-二甲基甲酰胺、三乙胺的检测方法、了解多肽AP-25在常规溶剂中的溶解性。了解残留溶剂的限度要求。

本品为化学合成的多肽，在水中的最大浓度为5mg/ml，在0.1mol/L氢氧化钠中的最大浓度为28mg/ml。

通过了解各种化合物的沸点、化学稳定性以及常规的检测手段，在此基础上找到适合的检测方法。药物中残留有机溶剂检测通常采用直接进样与顶空进样气相色谱法。顶空进样方式较为普遍,但很多药物热稳定性差、受热易分解,并且部分药物难溶于传统顶空溶剂,或所用顶空溶剂对待测组分具有较低的顶空效率,这部分药物中残留有机溶剂仍采用直接进样法测定。乙腈，二氯甲烷，甲醇，乙酸，三氟乙酸，哌啶，N,N-二甲基甲酰胺都易溶于水，可以以水为溶剂进行进样。乙醚，1,2-乙二硫醇，苯甲硫醚，三乙胺则以乙醇为溶剂，苯酚可以以醚为溶剂进行进样。

有机溶剂的限度及测定方法经查阅文献，列表如下：

参考文献

A专著

[1]杨绍英,陈志华.气相色谱法检测药物中的残留溶剂.天津药学.1996,8(4):71一72

[2]刘虎威,气相色谱方法及应用,北京:化学工业出版社,134;143一149;152一154

[3]中国药典2000年版.附录ⅧP有机溶剂残留量测定法

[4]中国药典2000年版.附录H.生物制品通则

[5]霍秀敏,王卫,袁雯玮.气相色谱法测定卡维地洛中有机溶剂残留量.天津药学.2000,12(3):61一62

[6]程速远. 生化药物、基因工程药物中残留溶剂及生物制品中防腐剂测定的研究[D]. 中国药品生物制品检定所 2004

[7]Kevin J Mulligan, Heather McCauley. Factors That influence the Determination of Residual Solvents in Pharmaceuticals by Automated Static Headspace Sampling Coupled to Capillary GC一MS. Journal of Chromatographic Science,1987:883一889

[8]Mirali FARAJZADEH, Alireza MARDANIB. Analysis of Residual Solvents In Ampicillin Powder by Headspace Spectrophotometric Method. ANALYTICAL SCIENCES.2002,(18):171一175

[9]R.J. Markovich, S. Ong, J. Rosen. Quantitation of the Residual Solvent Naphtha in a Pharmaceutical Soft Gelatin Capsule Product by Equilibrium Headspace Gas Chromatography. Journal of Chromatographic Seience.1997,35(12):584一592

[10]Chen Xiaoyuan, Plasencia Carmen, Hou Yingping, et al. Synthe sis and biological evaluation of dimeric RGD peptide paclitaxel conjugate as a model f or integrintargeted drug delivery . Journal of Medical Chemistry, 2005, 48( 4) : 1098-1106.

[11]Cudic Mare, Mari Frank, Fields Gregg B. Synthesis and solidphase application of suitably protected γ-hydroxyvaline building blocks . Journal of Organic Chemistry, 2007, 72( 15) : 5581-5586.

B期刊文章

[1]纪建国,叶蕴华,邢其毅,植物多肽类化合物研究进展,《天然产物研究与开发》1998年第03期

[2]庄秀英,王仲山,尤时龙等.原料药中有机溶剂残留量的气相色谱测定.药物分析杂志.1983,2:82

[3]武秀娟,宋育文.气相色谱法测定RU486中有机溶剂残留量的研究.药物分析杂志.1992,12(1):54一55

[4]李维庸,蔡玉云,赵士英.十二种化学原料药品中有机溶剂残留量的气相色谱法测定.药物分析杂志.1985,5(5):245一247