论文总字数：29029字

摘 要

细胞核酸结合蛋白(CNBP)是一种与单链DNA（ssDNA）和RNA结合，并且参与翻译和转录的控制过程的锌指蛋白。它有七个连续重复的CCHC锌指重复序列和一个RGG区域，又称为锌指蛋白9（ZNF9）。到目前为止，已经从人、鼠、斑马鱼等中克隆出了CNBP的 cDNA，这些cDNA在氨基酸和核苷酸水平上都具有高度的保守性。CNBP是一个必需的基因，其缺失会导致早期胚胎发育致命性 。研究发现，在精子发生过程中，CNBP在睾丸中高水平分布并表达。然而，目前关于CNBP在斑马鱼睾丸中的位置和功能尚不清楚。

本研究以斑马鱼为模型，先进行 CNBP基因表达序列在不同物种的同源相似性比较，再利用RT-PCR来测定斑马鱼不同胚胎发育时期CNBP的表达以及同一时期CNBP的器官特异性表达，绘制了斑马鱼成鱼的CNBP表达谱，发现斑马鱼成鱼肝脏、睾丸、眼睛、鱼鳔、肠、胆和脑组织中均有CNBP的表达以及斑马鱼早期胚胎发育至24phf时CNBP高表达。这将为重点研究CNBP在斑马鱼睾丸发育中的作用机制提供重要依据，使得男性不孕症得以诊治。

关键词：CNBP 锌指蛋白 斑马鱼 不孕不育

Determination of CNBP expression profile in zebrafish and its role in embryogenesis and spermatogenesis

Abstract

Cellular Nucleic Acid Binding Protein (CNBP) is a zinc finger protein that binds to single-stranded DNA (ssDNA) and RNA and is involved in the control of translation and transcription. It has seven consecutive repeats of the CCHC zinc finger repeat and an RGG region, also known as zinc finger protein 9, ZNF9. So far, CNBP cDNAs have been cloned from human, mouse and zebrafish, which are highly conservative at the amino acid and nucleotide levels.CNBP is an essential gene whose deletion leads to lethal development of early embryos. The study found that CNBP is highly distributed and expressed in the testis during spermatogenesis. However, the current location and function of CNBP in the zebrafish testis is unclear.

In this study, zebrafish was used as a model to compare the homologous similarities of CNBP gene expression sequences in different species. Then, the expression of CNBP in different embryonic development stages and organ-specific expression of CNBP in the same period were determined by RT-PCR. The CNBP expression profiles of adult zebrafish were drawn. It was found that liver, testis, eyes, swim bladder, intestine, gall and brain tissues of adult zebrafish. The expression of CNBP was found in all of them, and the expression of CNBP was high in zebrafish embryos at 24 phf. This will provide an important basis for investigating the mechanism of CNBP in zebrafish testicular development, so that male infertility can be diagnosed and treated.

Key Words: CNBP; zinc finger protein; zebrafish; infertility

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 细胞核酸结合蛋白（CNBP）概述 1

1.2 CNBP与精子发生的相关性及其调控通路 2

1.3斑马鱼模型 3

1.4斑马鱼CNBP的功能研究 3

1.5本课题的研究内容及意义 3

2.1 实验材料与仪器 5

2.1.1实验仪器 5

2.1.2实验动物 6

2.1.3实验材料 6

2.2实验内容 8

2.2.1 CNBP基因表达序列在不同物种的同源相似性比较 8

2.2.2 CNBP的系统发生树 9

2.2.3 绘制CNBP基因相关蛋白数据图 9

2.2.4 同一时期斑马鱼CNBP的器官特异性表达 9

2.2.5 斑马鱼不同胚胎发育时期CNBP的表达 15

第三章 实验结果与讨论 19

3.1 CNBP基因表达序列在不同物种的同源相似性比较 19

3.2 CNBP的系统发生树 20

3.3 CNBP基因相关蛋白数据图 21

3.4 CNBP基因PCR产物凝胶电泳结果 22

第四章结论与展望 29

4.1 本文结论 29

4.2未来展望 29

参考文献 30

致谢 34

第一章 文献综述

1.1 细胞核酸结合蛋白（CNBP）概述

细胞核酸结合蛋白（CNBP）是一个惊人的脑发育所需的锌指核酸分子伴侣，也称为锌指蛋白9，包含7个高度保守的半胱氨酸-半胱氨酸-组氨酸-半胱氨酸型锌指结构域,而且在第一和第二锌指之间有一个精氨酸/甘氨酸富集区，与精氨酸-甘氨酸-甘氨酸极为相似[1]。CCHC型锌指基序具有多种生物学活性（如与DNA结合和RNA结合），也可介导蛋白质-蛋白质相互作用[2]。2003年McGrath等人发现CNBP与逆转录病毒核衣壳蛋白具有显著的序列相似性[2]。CNBP cDNA已从哺乳动物，鸡肉和两栖动物、斑马鱼中克隆，并且在氨基酸和核苷酸水平上均表现出高度保守[3、4-6]。斑马鱼与人类CNBP的氨基酸序列具有高度同源性，高达80%[7]。

CNBP表达模式复杂且动态性强。在胚胎发生过程中，CNBP的表达模式已经在蟾蜍、爪蟾、斑马鱼、老鼠和鸡中进行了分析[8]。在早期胚胎发生过程中，在未受精的青蛙、斑马鱼、牛、鸡和小鼠的所有胚胎细胞中都可以检测到CNBP mRNA[8]。在小鼠胚胎发生过程中，CNBP通过靶向c-myc在前后轴、颅颌面和肢体发育过程中的细胞增殖和组织模式中起着重要作用[9]，对诱导和分化前脑很重要[10]。在小鸡器官发生过程中，CNBP通过调节其他的头端转录因子来调节头端发育中的前脑形成[11]。通过基因序列的比对，发现ZCHHC13(锌指，含CCHC域)在斑马鱼中与其同源的是CNBP，该基因早在2004年在斑马鱼中首次被报道，并在其表达谱上发现集中表达在卵巢中[3]。在斑马鱼发育过程中，CNBP还在平衡神经嵴细胞凋亡和增殖中具有重要作用，CNBP的功能丧失对颅骨NCC亚群的形成和存活产生不利影响，导致其减少或损失[12]。许多斑马鱼大脑区域（如视网膜、嗅球、下丘脑、小脑和脊髓）的总体结构与人脑结构相似，尽管远足和哺乳动物确实存在差异[13，14]，但是主要的神经递质系统，都已在斑马鱼的大脑区域中呈现出来了。CNBP还与人类肌肉疾病有关联，如肌强直性营养不良2型（DM2，近端肌强直性肌病，OMim 602668）[15]和年龄相关的散发性包涵体肌炎（SIBM）[16]。一些研究表明，CNBP调节巨噬细胞集落刺激因子（CSF1）、c-myc原癌基因、Wnt信号通路成分和促炎细胞因子的表达[17-20]。另有研究发现，敲除CNBP会导致生精小管的完整性受损，使其生殖细胞存活率降低，易导致男性不孕不育[21]。

1.2 CNBP与精子发生的相关性及其调控通路

在体细胞和精原细胞中主要的CNBP表达模式可能与精子增殖有关；早期生殖细胞中会进行大量的RNA转录和蛋白质合成活动，而CNBP对单链核酸具有很高的亲和力，并与mRNA调控区结合，因此，睾丸体细胞和生殖细胞的表达差异与转录和翻译活性差异有关[22]。此外，新生儿睾丸培养中生殖细胞凋亡可能是CNBP抑制的间接结果，并且CNBP可以调节新生儿睾丸发育，特别是通过Wnt/β-catenin途径影响支持细胞[21]。包含SSC和转运扩增祖细胞的未分化精原细胞响应Wnt /β-catenin信号。β-catenin的遗传消除表明Wnt/β-连环蛋白信号传导促进这些细胞的增殖。另有研究表明，CNBP可以调节新生小鼠睾丸发育，抑制CNBP的表达将促进Wnt/β-catenin通路的活化，Wnt/β-catenin通路是支持细胞中CNBP的关键靶点之一，并且在小鼠精子发生过程中起重要作用[8]。

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