论文总字数：21231字

摘 要

目的：建立一种基于手性配位交换原理的反相HPLC法，以分离测定原料药L-苹果酸中的异构体杂质D-苹果酸。方法：采用SUMICHIRAL OA-5000L手性柱（4.6×150mm，5µm）；流动相：水相：异丙醇=85：15（醋酸调节PH值至5.0）；柱温：35℃；检测波长：280nm；流速：1.0ml/min；进样量：5μl。为确定原料药L-苹果酸中的异构体杂质D-苹果酸的含量，本文采用外标法进行测定。结果：D-苹果酸与L-苹果酸峰之间的分离度为6.094，分离度良好。线性方程为Y=3.752×10³X -6.097×10²,R=0.9999（n=7），在0.8104μg/ml-28.36 μg/ml范围内线性关系良好。重复性的RSD为1.16%，重复性良好；中间精密度的RSD为2.09%，中间精密度良好；平均回收率（n=9）为99.18%，其RSD为1.21%。样品溶液在24小时内峰面积的RSD为0.082%，表明24小时内溶液稳定性良好。D-苹果酸的检测限为0.2431μg/ml,定量限为0.8104μg/ml。用该方法检未测出原料药L-苹果酸中的异构体杂质D-苹果酸。结论：经方法学验证，该方法快速简便，重现性好，灵敏度高，能够分离测定L-苹果酸中的异构体D-苹果酸。

关键词：HPLC L-苹果酸 D-苹果酸 异构体 SUMICHIRAL OA-5000L手性柱

Abstract

Objective: To establish a reversed-phase HPLC method based on chiral coordination exchange to separate and determine the isomer impurity D-malic acid in L-malic acid .Methods: A SUMICHIRAL OA-5000L chiral column (4.6×150mm, 5µm) was used.The mobile phase was aqueous phase: isopropanol = 85:15 (adjust pH to 5.0 with acetic acid).The column temperature was 35℃.The detection wavelength was 280nm.The flow rate was 1.0ml/min.The injection volume was 5μl. The content of D- malic acid was determined by external standard method. Results: the resolution between D-malic acid and L-malic acid peak was 6.094. The linear equation was Y=3.752×10³X -6.097×10²,R=0.9999 (n=7), and the linear relationship is good in the range of 0.8104μg/ml-28.36 μg/ml. The RSD of repeatability was 1.16%, which indicated that the repeatability was good. The RSD of intermediate precision was 2.09%, which indicated that the intermediate precision was good. The average recovery rate (n=9) was 99.18% and its RSD was 1.21%. The RSD of the peak area of the sample solution within 24 hours was 0.082%, indicating that the solution stability was good within 24 hours.The limit of detection（LOD） was 0.2431μg/ml and the quantification(LOQ) was 0.8104μg/ml of D-malic acid. No D-malic acid in L-malic acid was detected by this method. Conclusion: the method has good reproducibility and high sensitivity, and can be rapidly and simply used for the separation and determination of enantiomer D-malic acid in L-malic acid.

Key Words: HPLC; L-malic acid; D-malic acid; enantiomer；SUMICHIRAL OA-5000L

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

第二章 实验部分 5

2.1实验仪器与试剂 5

2.1.1仪器设备 5

2.1.2药品和试剂 5

2.2色谱条件 5

2.3溶液的制备 5

2.3.1流动相的制备 5

2.3.2对照品溶液的制备 6

2.3.3供试品溶液的制备 6

2.4方法学验证 6

2.4.1专属性实验 6

2.4.2线性实验 6

2.4.3检测限与定量限实验 6

2.4.4进样精密度实验 7

2.4.5重复性实验 7

2.4.6中间精密度实验 7

2.4.7回收率实验 7

2.4.8稳定性实验 8

2.4.9耐用性实验 8

2.5样品测定 8

2.6结果与分析 9

2.6.1专属性 9

2.6.2线性范围 10

2.6.3检测限与定量限 10

2.6.4进样精密度 10

2.6.5重复性 11

2.6.6中间精密度 11

2.6.7回收率 11

2.6.8稳定性 12

2.6.9耐用性 13

2.7样品测定结果 14

2.8讨论 14

2.8.1色谱柱的选择 14

2.8.2检测波长的选择 14

2.8.3铜离子浓度的选择 16

2.8.4流动相比例的选择 17

2.8.5柱温的选择 18

2.8.6流速的选择 19

2.8.7进样体积的选择 19

2.9结论 19

参考文献 21

致 谢 25

第一章 文献综述

苹果酸的结构式为，因为一具有个不对称的碳原子，因此是手性化合物，有D-苹果酸和L-苹果酸两种异构体。自然中不存在天然的D-苹果酸，只有通过化学合成才能得到，合成得到的一般是他们的外消旋体DL-苹果酸，然后通过拆分技术得到较纯的两种苹果酸对映体，其中只有 L-苹果酸得到广泛应用。L-苹果酸的化学名称为2-羟基γ-二酸或L-羟基苯二酸，动植物和微生物可以通过TCA循环这一生物代谢途径产生，其电离常数为常数K1为3.9×10^-4 、K2为7.5×10^-6[1]，是一种酸性较强的有机酸。 L-苹果酸在常温下为白色结晶或结晶性粉末，易溶于水，无臭，但具有较强的吸湿性因此应注意干燥保存。 在食品行业，L-苹果酸被认为是一种理想的添加剂，虽然它的味道与天然苹果的酸味相接近，酸度也比柠檬酸大，但味道柔和，产生的热量更低并且具有更加特殊的香味因而受到诸多青睐。二十世纪六十年代，L-苹果酸就被美国食品和药品管理局登记确认为是一种安全、无毒、无害、可食用的有机酸[2]。

L-苹果酸的应用不仅仅体现在食品行业，近几年随着医药卫生事业地不断发展，L-苹果酸在医药行业也发挥着越来越重要的作用。天然的L-苹果酸由于是生物体代谢途径——TCA循环及其支路乙醛酸循环产生的，因此能够被人体直接吸利用，参与线粒体的能量代谢过程，具有消除疲劳、使人体迅速回复体力的作用。Callis等人[3]的研究发现L-苹果酸之所以能够让起到抗疲劳的作用，是因为它在人体内合成瓜氨酸-苹果酸盐，这是一种复合盐，可以通过参与机体的代谢活动，消除人的疲劳感。此外，日本科学家Svgiyama等人[4]的研究发现，L-苹果酸还可以减少癌症患者的痛苦，降低抗癌药物给他们带来的不良反应和毒副作用，这是因为从白芷根中的L-苹果酸钠能有效地保护肾脏和骨髓免遭抗癌药物的毒性侵害，同时又对不降低药物活性。为了让药物在生物体内稳定的存在，使其得到更好的吸收，近几年来L-苹果酸也经常被用作药物稳定剂。复合氨基酸注射液就是一个典型的案例，它利用L-苹果酸具有较强的酸性这一性质，调节其pH,同时L-苹果酸液作为组分之一，提高了注射液在体内的利用率，广泛用于高血压、尿毒症等方面的治疗，此外还可降低抗癌药物对机体正常细胞带来的毒副作用，是常用于癌症放化疗后的辅助药物[5]。L-苹果酸的各种盐类物质对生物体具有很好的疗效，它的钙盐相比于牛奶、碳酸钙等具有更好的吸收，可作为青少年日常补钙的来源，可避免老年人引起骨质疏松；它的钠盐是治疗肝功能不全特别是高血压症的有效药物；它的钾盐能保持人体水分平衡，能够有效治疗水肿、高血压和脂肪积聚症等疾病。

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