摘 要

目的：为了研究冬凌草甲素促进人骨肉瘤HOS的凋亡效应，考察冬凌草甲素作用于HOS细胞后，是否可以使其凋亡。方法:使用具有浓度梯度的冬凌草甲素分别添加到含HOS细胞的培养皿中，使用MTT的方法检测阻碍增殖细胞的百分比。用Annexin V-FITC/PI双染法测定处于细胞周期早期和晚期的细胞，它们的死亡的百分比来验证冬凌草甲素对HOS死亡产生的效果。用western blot可以测定出Bax, Bcl-2, Caspase-9，caspce3 四种蛋白在细胞里的表达状况，进一步确证HOS细胞凋亡。结果:通过一系列调亡实验发现，各种浓度的冬凌草甲素对HOS细胞凋亡的诱导效应有很大区别，并且表现为随着浓度的增加诱导效应加强，蛋白印迹法测出其对蛋白具有上调和下调的能力，这就说明了冬凌草甲素这种化学物质可以产生引发HOS细胞死亡的效果。

关键字: 冬凌草甲素 HOS细胞 凋亡

Experimental study on the effect of oridonin on HOS apoptosis in human osteosarcoma cells

Abstract

OBJECTIVE: To investigate the effect of oridonin on the apoptosis of human osteosarcoma (HOS), and to investigate whether oryzanol may play an important role in the apoptosis of HOS cells. METHODS: Oridonin with a concentration gradient was added to a Petri dish containing HOS cells, respectively, and the percent inhibition of proliferating cells was determined by MTT assay. The effect of oridonin on the apoptosis of HOS was evaluated by the percentage of apoptotic cells in early and late stages by Annexin V-FITC / PI double staining. The expression of bax, caspase9, bcl2 and caspx3 was determined by western blot, and the molecular characteristics of HOS cell apoptosis were further determined. RESULTS: Through a series of apnea experiments, it was found that the effects of various concentrations of oridonin on cell apoptosis were significantly different, and the induction effect was enhanced with the increase of concentration. Protein has the ability to up-regulate and down-regulation, which also shows that oridonin can induce HOS cell apoptosis.

Key Words: Oridonin ；HOS cells ；apoptosis

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1冬凌草甲素的基本性质 2

1.2冬凌草甲素的药理及药效作用 2

1.2.1促进癌细胞的死亡以及阻碍癌细胞生长时所需要的时间 2

1.2.2阻碍某些通道信号的传导来实现降低细胞的繁殖 3

1.2.3降低端粒酶活性 3

1.2.4抗突变作用 4

1.2.5增强其他抗肿瘤药物的疗效 4

1.3冬凌草甲素的研究现状 4

1.4骨肉瘤的现状 5

第二章材料和方法 6

2.1材料 6

2.1.1细胞株 6

2.1.2药 物 6

2.1.3试 剂 6

2.2 仪 器 6

2.2.1 YJ-875型医用净化工作台 6

2.2.2 311型水套式CO2培养箱：Thermo Forma 7

2.2.3XD-101型倒置显微镜 7

2.2.4 LD4－2普通离心机 7

2.2.5 全波长荧光酶标仪 7

2.2.6Mini-Protean 3电泳槽 7

2.2.7 Power PacTM Basic 基础电源 7

2.2.8半干式转膜槽 7

2.2.9THZ-312型台式恒温振荡器 7

2.2.10 Odyssey近红外荧光扫描成像系统 7

2.2.11 FACSCalibur流式细胞仪 7

2.2.12 脱色摇床 7

2.3实验方法及原理 7

2.3.1体外细胞培养 7

2.3.2 MTT法测定细胞活力 7

2.3.3 Annexin-V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡 8

2.3.4 蛋白质印迹测定 9

第三章 结果与讨论 11

3.1 MTT结果 11

3.2 Annexin-V/PI双染流式结果 11

3.3蛋白质印迹测定法结果 12

第四章 结论 13

参考文献 14

致谢 16

第一章 文献综述

冬凌草，是唇形科香茶菜属植物里的一种。全世界大概有150种的样子。在国外许多地方都有分布。它在我国也有很广泛分布，主要分布在我国13个省内^[1]。冬凌草有很苦的味道，有一定程度上的寒性，也有清热的效果；能够解毒和抵抗炎症，减轻疼痛和抗肿瘤的作用^[2]。冬凌草甲素在本世纪70 年代时期，被中国学者经过实验从植物中第一次分离出来，是一种天然的有机化合物。据报道，冬凌草甲素（ORI）能够抑制各类癌细胞株的增殖以及诱导其细胞的凋亡，所以现在社会对冬凌草的需要量也越来越大。天然生长的冬凌草已经被人类采摘的几尽枯竭，不过值得欣慰的是冬凌草的人工种植技术已经在一定程度上成熟，有些研究也报告说在通过一些合成技术的实验，期望可以培育出含冬凌草甲素高的冬凌草品种。这样为实验研究提供了丰富的材料基础。现如今冬凌草甲素主要是用乙醇法和乙醚法提取出来的。乙醚法是主要满足于科研实验药物的需求。因为乙醚、甲醇、苯用的使用量比较多, 会对人产生有害影响并且容易燃烧, 故只能适用于小剂量的提取而不适合于工业化的生产,。但是，此法收率相比之下会高一些。乙醇法主要在工业生产中使用，用毒性小的工业乙醇替代乙醚和甲醇，这样可以减小生产毒性且生产成本。但是弊端是产量较低，只有约0.2％^[3] 。已报道的的各种类研究中，冬凌草甲素在许多癌细胞，如淋巴瘤细胞，结肠癌，乳腺癌和血癌的细胞中都可以使细胞的生长受到抑制，进一步促进细胞的死亡。不过，目前对于其这个功能的确切机制还不是特别清楚。但是，可以肯定的是冬凌草甲素在研究中确实会对癌细胞产生一定的效果。因而可以进一步探究它对骨肉瘤的产生的效果。骨肉瘤是一种恶性的肿瘤，非常常见并且它还具有原发性^[4]。在青少年和孩童时期最为常见^[5]。良好的计划治疗，可以让骨肉瘤的长期存活率已改善至〜70％，但是转移性骨肉瘤的长期生存率在过去的几十年里停滞不前。 因此，有必要探索和开发更有效的抗癌药物。本课题旨在研究以人骨肉瘤细胞HOS为研究对象，以冬凌草甲素诱导其凋亡，对细胞凋亡的各项指标进行测定，并对测得数据进行处理。

1.1冬凌草甲素的基本性质