摘 要

核苷类药物是一类具有抗病毒以及抗肿瘤功效的生物大分子，它们被广泛地应用于临床治疗。在合成核苷类化合物的方法中，化学法是最常见最经典的手段，然而使用化学法合成时需对活性基团进行保护与脱保护，需要对同分异构体进行分离，而酶法合成则不需要对基团进行保护与脱保护并且具有很好的区域选择性及立体选择性，越来越受到人们的重视。克拉屈滨( cladribine) 化学名为 2-氯-2'-脱氧腺苷( 2-chloro-2'-deoxy-adenosine) ，是一种腺苷脱氧酶抑制剂，主要用于急性或慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、皮肤 T 细胞淋巴瘤、毛细胞白血病以及非何杰金氏淋巴瘤等多种肿瘤的治疗。因此探寻出高效酶法合成克拉屈滨具有极大的应用价值以及潜在的市场价值。本实验以核苷磷酸化酶为生物催化剂，以尿苷和2-氯-6-氨基嘌呤为底物酶法合法克拉屈滨，并运用控制变量法，在不同酶添加量、反应pH、反应温度、底物摩尔比、反应时间的条件下进行试验，以达到优化生产条件的目的。优化结果为酶添加量为2 U/mL， 反应pH为8.0，反应温度为55°C，底物摩尔比为尿苷:2-氯-6-氨基嘌呤=3:1，反应时间控制在3小时，产率可达46%。

关键词：核苷类似物 克拉屈滨 核苷磷酸化酶 反应条件

Highly Enzymatic Synthesis of Anti - leukemia Drugs- Cladribine

Abstract

Nucleoside drugs are a class of biological macromolecules with antiviral and antitumor effects, which are widely used in clinical treatment. Chemical methods are the most common and most classical means in the synthesis of nucleoside compounds. However, the use of chemical synthesis requires the protection and deprotection of the active groups, the separation of the isomers, and the enzymatic Synthesis does not require the protection and deprotection of the group and has a good regional selectivity and stereoselectivity, more and more people's attention. The cladribine chemistry, called 2-chloro-2'-deoxy-adenosine, is an adenosine deoxygenase inhibitor that is used primarily for acute or chronic myeloid cells Leukemia, chronic lymphocytic leukemia, skin T-cell lymphoma, hair cell leukemia and non-Hodgkin's lymphoma and other tumors. Therefore, it is of great application value and potential market value to find out the high performance enzymatic synthesis of cladribine. In this study, the nucleoside phosphorylase was used as the biocatalyst, and the uridine and 2-chloro-6-aminopurine were used as the substrate for the enzymatic method. The control method was used to determine the amount of the enzyme, Temperature, substrate molar ratio, reaction time under the conditions of the test, in order to achieve the purpose of optimizing the production conditions. The reaction temperature was 55 ° C, the molar ratio of substrate was uridine: 2-chloro-6-aminopurine = 3: 1, and the reaction time was controlled at 3 Hour, the yield up to 46%.

Key words: Nucleoside analogues; Cladribine; Nucleoside phosphorylase；Reaction conditions

目录

摘要 II

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 核苷类似物综述 1

1.1.1 核苷 1

1.1.2核苷类似物 2

1.1.3 克拉屈滨简介 3

1.2核苷类药物的合成方法 4

1.2.1化学法 4

1.2.2酶法 5

1.3 本课题研究内容和研究意义 7

1.3.1 研究内容 7

1.3.2 研究意义 7

第二章 实验材料与方法 8

2.1 实验材料 8

2.1.1 实验试剂 8

2.1.3 仪器与设备 9

2.2实验试剂的使用与配置 10

2.2.1 培养基及培养条件 10

2.2.2 蛋白电泳相关溶液配置 10

2.3实验方法 13

2.3.1 核苷磷酸化酶活力测定及克拉屈滨产率的计算 13

2.3.2酶添加量与产量的关系 14

2.3.3反应pH对其转化率的影响 14

2.3.4 反应温度与产量的关系 15

2.3.5底物摩尔比与产量的关系 15

2.3.6 反应时间与产量的关系 16

第三章 结果与讨论 17

3.1酶添加量的条件优化 17

3.2 反应pH的条件优化 17

3.3反应温度的条件优化 18

3.4 底物摩尔比的条件优化 18

3.5反应时间的条件优化 19

第四章 结论与展望 20

4.1 实验结论 20

4.2 展望 20

参考文献 21

致 谢 23

第一章 文献综述

1.1 核苷类似物综述

1.1.1 核苷

核苷酸是由嘌呤或嘧啶碱基，核糖或脱氧核糖和磷酸三种物质组成的小分子化合物，是构成生物遗传物质DNA，RNA物质的基础。 其关系见图1.1。

图1-1 结构关系

核苷酸与生物遗传物质之间紧密的相关性，使得核苷酸化合物在生物遗传代谢中同样有重要地位。不仅如此，核苷酸分子在调节生理功能方面同样发挥了重要作用，表现为参与许多身体其他生化反应。三磷酸腺苷（ATP）在生物体中充当 “能量货币”的重要角色，参与机体中包括物质运输，肌肉运动等与能量相关的绝大多数反应，腺苷和其他物质一同构成了几类辅酶。与此之外，核苷酸的调节作用体现在许多碱代谢过程中，他们维持着机体的生长、发育和繁殖。例如，在乳制品加入适当多的核苷酸，可保护胃肠道，提高食用者免疫力、汲取营养的能力，从而达到抵御疾病的目的。
核苷酸类物质是生物代谢过程中有着重要地位，且推动着诸多学科领域的发展。在药品研发领域，许多药物是在核苷酸及核苷的背景下加以研究，最终改造成新型药物。在食品工业中，肌苷酸和鸟苷酸是普遍的增鲜剂，它们可以大大改善事物的口感。PCR技术也与核苷酸类物质密不可分，脱氧核苷三磷酸、核苷三磷酸则奠定了该技术的发展。

1.1.2核苷类似物

天然核苷酸发生取代反应后，新生成的分子与被取代部分相似结构，叫做核苷酸类似物。它们有与核苷酸类似的性质，可以进入到遗传物质中置换天然的核苷酸分子，影响基因的复制、转录或者表达，核苷类似物也因此被用于药物合成、基因工程等诸多方面的研究。

致病性病毒在人类间传播的种类不少于160种，这其中部分可严重威胁生命。核苷类似物在治愈不论是感染遗传物质是DNA还是遗传物质是RNA的病毒的患者方面，具有不可替代的意义。病毒性疾病对于人类来讲，是降低生活质量的常见且多发的疾病，根据不完全统计，半数以上的流行传染病发病以原因是病毒感染。

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