论文总字数：15382字

摘 要

雷公藤甲素是雷公藤提取物的主要活性成分之一，不仅具有抗炎以及免疫抑制作用，还有抗肿瘤作用，是热点研究的天然活性化合物。然而由于其水溶性差、治疗窗窄，并具有严重的不良反应，其中对男性生殖毒性及抗生育作用尤为明显，使其临床应用受到了严重的限制。因睾丸支持细胞与生精细胞的生长发育密切相关，本实验以睾丸支持细胞为研究对象，通过体外细胞实验，研究雷公藤甲素能否诱导支持细胞凋亡并进行多种凋亡指标验证，探讨雷公藤甲素的生殖毒性。

关键词：支持细胞 细胞凋亡 雷公藤甲素

Experimental Study of Triptolide induces apoptosis of Sertoli cells

Abstract

Triptolide is one of the main active components of TWH, not only have anti-inflammatory and immunosuppressive effects, as well as anti-tumor effect, is a natural active drug attracting research focus. However, due to its poor water solubility, narrow therapeutic window, and have serious side effects, the male reproductive system and the antifertility effect are particularly obvious, its clinical application is severely limited. In this experiment, Sertoli cells were studied by in vitro experiments, research whether triptolide can induce apoptosis of Sertoli cells and carry on Verification of multiple apoptotic indexes, then investigate triptolide reproductive toxicity.

Keywords: triptolide；sertoli cells；apoptosis

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1前言 1

1.2对雷公藤甲素的药理作用研究 1

1.2.1抗炎作用 1

1.2.2对血管生成的抑制作用 2

1.2.3对细胞因子作用 2

1.2.4诱导细胞凋亡的研究 2

1.3支持细胞 4

1.3.1支持细胞的概述 4

1.3.2支持细胞的功能 4

1.4细胞凋亡 5

1.5细胞凋亡的测定方法 6

第二章 雷公藤甲素诱导睾丸支持细胞凋亡的测定方法 7

2.1实验试剂 7

2.2细胞培养 7

2.3细胞活性检测 7

2.4 TP处理对支持细胞的形态影响 7

2.5琼脂糖凝胶电泳 8

2.6膜联蛋白V-FITC /碘化丙啶（PI）染色 8

2.7线粒体膜电位检测（ΔΨm） 8

第三章 结果与讨论 8

3.1细胞活性检测 9

3.2 TP对支持细胞形态的影响 9

3.3 琼脂糖凝胶电泳 10

3.4 膜联蛋白V-FITC /碘化丙啶（PI）染色 10

3.5 线粒体膜电位测量（ΔΨm） 11

第四章 结论与展望 12

4.1结论 12

4.2展望 12

参考文献 13

致谢与结语 16

第一章 文献综述

1.1前言

雷公藤甲素(triptolide)^[1]又称雷公藤内酯醇，简称TP，提取自卫矛科植物雷公藤的根、叶、花及果实中，它是一种环氧二萜内酯化合物，是雷公藤提取物的主要活性成分之一，现在是热点研究的天然产物。雷公藤甲素几乎不溶于水，易溶于甲醇(CH₃OH)、二甲基亚砜(DMSO)、无水乙醇(CH₅OH)、氯仿(CHCl₃)、乙酸乙酯(C₄H₈O₂)等有机溶剂。雷公藤甲素具有抗炎作用、免疫抑制作用以及抗肿瘤作用^[2]。然而由于其水溶性差、治疗窗窄，并具有严重的不良反应，特别是男性生殖毒性，使其临床应用上受到了严重的限制。研究表明,雷公藤甲素药理作用的发挥和不良反应的产生都与其诱导细胞凋亡的能力紧密相关^[3-4]。本课题以睾丸支持细胞为研究对象，通过体外细胞实验，研究雷公藤甲素能否诱导支持细胞凋亡，探讨雷公藤甲素的生殖毒性^[5]。

1.2对雷公藤甲素的药理作用研究^[6]

1.2.1抗炎作用

目前认为滑膜细胞的活化和增生能够导致类风湿性关节炎中关节软骨和骨组织的损伤，细胞凋亡过程异常对患有类风湿性关节炎的病人发病有很大的影响，滑膜细胞凋亡过低会导致滑膜细胞的过度增生，低浓度的雷公藤甲素对滑膜细胞作用后可使其活性下降，使滑膜细胞的增生受到抑制，导致细胞凋亡^[7]。有些研究的分析结果表明^[8]，以人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞作为体外培养实验的研究对象，肿瘤坏死因子(TNF)诱导所引发的类风湿关节炎滑膜成纤维细胞环氧化酶诱导型一氧化氮合酶(NOS)的表达，以及TNF诱导产物前列腺素E2(PGE2)等物质的生成都能明显受到雷公藤甲素的抑制，且随雷公藤甲素浓度的升高抑制作用更加明显。

1.2.2对血管生成的抑制作用

EC(内皮细胞）的增殖在经过低浓度的雷公藤甲素处理后能受到显著的抑制，随雷公藤甲素浓度的增加抑制作用更加显著，这表明雷公藤甲素对血管内皮细胞的增生具有抑制作用，且有浓度依赖性^[9]。这个结论和以前的研究结论对比是一致的，但现在还不能确定其具体的作用机制，而且国内外针对于血管内皮细胞迁移活性是否受到雷公藤甲素影响的研究还很少。经过研究发现，脐静脉内皮细胞在体外培养迁移活性较强，细胞的迁移经过低浓度的雷公藤甲素处理后可以受到很好的抑制，且表现出对雷公藤甲素的浓度依赖性，经雷公藤甲素作用后的脐静脉内皮细胞迁移能力基本失去了。经常作为研究血管生成的理想模型的鸡胚尿囊膜血管是非常丰富的，鸡胚尿囊膜的血管管腔经雷公藤甲素处理后内径变小、数量减少，特别是新生小血管数量减少的更加明显，进一步确定了血管生成会受到雷公藤甲素较强的抑制^[10]。

1.2.3对细胞因子作用

抑制免疫细胞NF-κB活力是雷公藤甲素抑制免疫细胞增殖、降低IL-2等多种炎症因子的生成、诱导细胞凋亡等多种免疫抑制效应的分子机制之一。一些研究^[11]显示小鼠T细胞早期活化标志CD69和CD25能受到雷公藤甲素的抑制，同时细胞因子vmRNA的表达也能受到抑制，这个研究表明这可能是其免疫抑制的作用机制之一。核因子-κB(NF-κB)作为重要的核转录因子，能大范围参与多种基因的表达调控，但前提要结合到多种基因的启动子或增强子的特定区域，其中包含了许多种黏附分子和细胞因子与免疫炎症反应密切联系；另外细胞的活化、增殖和凋亡均受到免疫细胞内NF-κB活性变化的影响，然后使整个机体的免疫状态受到影响。在该基础上，进一步对免疫抑制作用分子机制进行了研究^[12]，发现抑制蛋白(IKB)mRNA在Jurkat细胞中的表达水平可通过雷公藤甲素上调，造成细胞内IKB的增加进而使NF-κB的活力受到抑制。

1.2.4诱导细胞凋亡的研究

1. 对肿瘤细胞的作用

自从雷公藤甲素的抗肿瘤活性作用^[13]首次被发现以来，人们对雷公藤甲素的抗肿瘤作用作了大量的研究。据有关报道说：剂量为200-250ug/kg的雷公藤甲素可延长患白血病L615小鼠的存活期^[14]。

(2)对淋巴细胞的作用

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