论文总字数：23194字

摘 要

ABSTRACT Ⅵ

第一章 文献综述 1

1.1番茄红素的应用 1

1.2生物合成番茄红素的途径 1

1.3多酶合成常规构建方法 2

1.3.1基因顺序调控 2

1.3.2上游调控元件的替换 3

1.4多酶调控新策略 3

1.4.1多片段组装技术 3

1.4.2支架介导的多酶组装 4

1.5本课题的意义和目的 5

第二章 实验材料、方法及实验流程 7

2.1实验材料和设备 7

2.1.1实验试剂 7

2.1.2实验仪器 8

2.2实验方法 8

2.2.1培养基的配方及缓冲液的配制 8

2.2.2菌株和质粒 9

2.2.3引物设计 9

2.2.4携带标签的目的蛋白与锌指蛋白融合表达质粒的PCR扩增和纯化 9

2.2.5凝胶琼脂电泳（胶回收） 11

2.2.6凝胶琼脂电泳（验证） 11

2.2.7酶切 11

2.2.8凝胶琼脂电泳（胶回收） 12

2.2.9凝胶琼脂电泳（验证） 13

2.2.10连接 13

2.2.11转化 13

2.2.12菌落PCR 14

2.2.13凝胶琼脂电泳（验证） 15

2.2.14转化 15

2.2.15转接 15

2.2.16诱导 15

2.2.17SDS-PAGE测定蛋白质亚基分子量 15

2.2.18镍柱纯化His-tag蛋白质 16

第三章 实验结果与分析 18

3.1实验结果 18

3.1.1携带标签的目的蛋白与锌指蛋白融合表达质粒的构建 18

3.1.2关键酶的表达 22

3.1.3融合蛋白的纯化 23

3.2 结果分析 23

第四章 结论与展望 24

4.1结论 24

4.2展望 24

参考文献 25

致 谢 28

摘要

含锌指蛋白结合域的番茄红素合成关键酶的表达及纯化

番茄红素是自然界的一种天然的植物色素。也是在目前发现的最强的抗氧化剂之一，因而广泛受人关注。尽管番茄红素的研究与过去相比有了很大进展，然而其合成仍有较大的进步空间。

番茄红素在合成阶段需要经过多个酶的催化，所以采用目前研究较新颖的多片段组装技术和介导支架多酶组装技术，将关键酶组装到支架上，通过转化，将构建的含锌指蛋白结合域的番茄红素合成关键酶的重组质粒及其对应的支架导入大肠杆菌感受态细胞，一部分用于活化转接扩充所得质粒，另一部分用于转接诱导获取所求关键酶。进行验证的同时纯化关键酶基因所表达蛋白，进行体外支架体系的构建。本实验解决了融合蛋白表达和纯化的问题，为下一步的体外探索番茄红素的合成创造了条件。

关键词：番茄红素 多酶合成体系 基因调控 锌指蛋白

ABSTRACT

Expression and purification of the key enzymes containing zinc finger protein binding domain in lycopene synthesis with DNA scaffold

Lycopene is a natural plant pigment in nature. It is also one of the most powerful antioxidants found at present and has attracted wide attention. Although lycopene research has made great progress compared with the past, however, there is still much room for improvement in its synthesis.

Lycopene is catalyzed by multiple enzymes during the synthesis phase, so using novel technologies of fragment assembly and multienzyme assembly with scaffolds to assemble key enzymes onto DNA scaffolds. The target plasmids containing key enzymes with zinc finger protein binding domain and DNA scaffold were transformed into E.coli competent cells. One part for the activation transfer extended from plasmid, the other part is used to obtain induced key enzymes. At the same time, the expressed protein were purified to construct scaffold system in vitro. This experiment will solve the problems in expression and purification of fusion protein, and creat the conditions for further exploration of lycopene synthesis in vitro.

. Key Words:Lycopene;Multi enzyme synthesissystem;Gene regulation;

Zine finger protein

第一章 文献综述

番茄红素是一类C₄₀的异戊二烯化合物，最早从番茄中获得，因此称作番茄红素^[1]。1837年Hartsen首次提取出这种红色晶体；1910年Willstaller和Escher首次确定其分子式为C₄₀H₅₆；1913年Schunk正式将这种深红色针状晶体命名为番茄红素,由于其具有极强的抗氧化性、抗癌和抗炎作用而备受人所关注。以此带来的提高免疫力、预防和减缓肿瘤的功效而被广泛用于药剂等行业^[2]。

1.1番茄红素的应用

番茄红素在医药方面有着广泛的用途。一方面，番茄红素凭借其极强的抗氧化性，可以清除体内自由基，达到延缓衰老的功效；另一方面番茄红素还具有控制细胞GJIC^[3]的功能，通过控制细胞生长和细胞分化，使肿瘤得到预防和控制；同时番茄红素还可以抑制3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A，从而降低体内胆固醇。

1.2生物合成番茄红素的途径

请支付后下载全文，论文总字数：23194字