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摘 要

本研究旨在优化基因工程抗体技术中的聚合酶链式反应（PCR）技术来提高抗体的生产质量。通过比较使用不同的PCR酶和PCR方法总结出一种最优方案，能得到保真且特异的目的基因片段。

为了比较 LA Taq酶（LA酶）、Pyrococcus furiosus DNA 聚合酶（Pfu酶）和PrimeSTAR HS polymerase三种酶的扩增效果。本实验首先从抗X-gene单克隆抗体杂交瘤细胞中提取总RNA，设计引物，然后将RNA反转录成cDNA并进行加G修饰，为接下来的PCR测试做准备。分别用LA酶、Pfu酶和PrimeSTAR HS polymerase扩增抗体VH、VL基因片段，并设置阳性对照和阴性对照。将扩增出来的抗体VH、VL基因片段加A修饰后纯化，分别与载体连接，重组基因转化进入感受态细胞后，筛选出含有片段大小正确的目的基因的重组子送去测序。最后分析测序结果，比较得到Pfu酶是能得到高质量（突变率低）的抗体基因VL片段最优酶，PrimeSTAR HS polymerase是能得到高质量（突变率低）的抗体基因VH片段最优酶。在抗体生产中，使用Pfu酶对抗体VL基因片段进行PCR扩增，使用PrimeSTAR HS polymerase对抗体VH基因片段进行PCR扩增可提高生产效率。

关键词：基因工程抗体技术 单克隆抗体 PCR

Amplification and study of antibody gene（Program optimization）

Abstract

The aim of this study was to optimize the polymerase chain reaction(PCR) technology in genetically engineered antibody technology to improve the quality of antibody production.By comparing the use of different PCR and PCR methods to sum up an optimal solution,which can obtain high fidelity and specific gene fragments of interest.

In order to compare the amplification effects of LA Taq enzymes(LA enzymes), Pyrococcus furiosus DNA Polymerase(Pfu enzymes) and PrimeSTAR HS polymerase.In this study, total RNA was extracted from anti-X-gene monoclonal antibody hybridoma cells, primers were designed, then RNA was reverse transcribed into cDNA and added with G to prepare for the next PCR test.Antibody VH and VL gene fragments were amplified by LA enzyme, Pfu enzyme and PrimeSTAR HS polymerase respectively, and positive control and negative control were set.The amplified antibody VH and VL gene were modified and purified, and then ligated with the vector. After the recombinant gene was transformed into competent cells, the recombinant containing the correct size of the fragment was screened and sequenced.Finally, the results of sequencing were compared, and the Pfu enzyme was the best enzyme for the VL gene of the antibody gene, which was able to amplify high quality (low mutation rate). PrimeSTAR HS polymerase was the best enzyme for the VH gene of the antibody gene, which was able to amplify high quality (low mutation rate). In the antibody production, the antibody VL gene fragment was amplified by Pfu enzyme, and the PCR amplification of the antibody VH gene fragment using PrimeSTAR HS polymerase could improve the production efficiency.

Key Words:Genetically engineered antibody technology; Monoclonal antibodies; PCR

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1 背景 1

1.2 基因工程抗体研究进展 1

1.3 PCR技术 2

1.3.1 PCR技术简介 2

1.3.2 原理 2

1.3.3 目前常用的高保真酶及选择 3

1.4 研究目的及意义 4

第二章 实验材料与方法 5

2.1 实验材料 5

2.1.1 实验细胞 5

2.1.2 主要生物试剂 5

2.1.3 主要实验器材 6

2.1.4 常用试剂的配制 6

2.2 实验方法 7

2.2.1 总RNA提取 7

2.2.2 抗体VH、VL基因序列的扩增及分析 8

第三章 实验结果与分析 13

3.1 三种酶扩增目的基因的结果 13

3.2 菌落筛选结果 13

3.3 测序分析结果汇总与分析 16

3.3.1 测序分析结果汇总 16

3.3.2 测序分析结果分析 16

第四章 结论 17

参考文献 18

致 谢 20

第一章 绪论

1.1 背景

许多传染病由于病原体的特异性，使传染病的控制和根除非常困难，一般依靠疫苗进行预防。许多传染病一旦感染上就很难治愈，有的还会留下后遗症，甚至会危及生命。因此，制备用于诊断和治疗传染病的特异性抗体，对预防和控制传染病具有非常重要的意义，特别是当前基因工程抗体技术的发展，为抗体生产技术开辟了新的局面^[1]。该技术不仅具有快速合成抗体的优点，而且最大限度地保留了抗体与抗原结合的特性，可以更快更好地发挥其抗体的功能^[2]。

基因工程抗体技术用于抗体药物的研发，可以缩短时间，提高成功率，从而降低成本。目前该技术已经广泛应用于生物医药的许多领域，特别是在抗体研究方面取得了很大的研究进展^[3]。

1.2 基因工程抗体研究进展

随着对抗体结构和功能了解的深入及分子生物学技术的提高，对抗体进行人工基因重组^[4][5]，使工程化的抗体更适用诊断、研究和治疗等不同目的。抗体单链化和动物来源抗体的人源化^[6]是重组抗体技术的重点，其次是通过模拟抗体体细胞突变机理提高抗体表达的特异性和亲和性。抗体的基本结构是由两条重链和两条轻链组成，抗原结合部分与细胞效应部分分别位于抗体分子的N端和C端^[7]，通过蛋白酶裂解可分别产生Fab或F（ab）2及Fc片段^[8]。与抗体特异性相关的小片段VH、VL及CDR多肽^[9]，可通过基因工程在原核或真核细胞中人工表达。为了提高抗体小片段与抗原的结合能力，可在VH和VL之间插入15~20个氨基酸残基的连接链使之成为单链可变区片段（scFv），或者在VH和VL中引入半胱氨酸使二者形成二硫键稳定的可变区片段（dsFv）^[10]。

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