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摘 要

苯丙酮单加氧酶（PAMO）具有热稳定性，所以它不仅是一个生物催化剂，同时还具有吸引力。研究PAMO的结构时，为了方便于改变单加氧酶的底物特异性，经常将它的多个活性位点残基进行诱变研究。研究发现，突变体M446G PAMO具有将吲哚转化成靛蓝的能力。其中野生型PAMO不显示活性。目前针对PAMO的研究主要集中在定点突变野生型PAMO，对照研究M446G对吲哚的催化能力。在对结构的分析和对其催化机理研究中发现，M446的关键氨基酸位点位于PAMO的活性中心，对靛蓝介导的羟胺活化能力至关重要。在本研究中，使用定点突变技术来突变PAMO以制备突变体。对苯丙酮单加氧酶的M446G分析结果及其产物进行了研究。在这个实验中，PAMO的天然底物是苯基丙酮。用作溶剂模型以确定每种突变体的催化活性。

关键词：苯丙酮单加氧酶 靛蓝 定点突变 M446G

Modification of Monooxygenase for Indigo Preparation

ABSTRACT

Phenylacetone monooxygenase is an attractive biocatalyst due to its thermal stability. Among them, M446G PAMO mutants were able to convert indole into indigo. And, wild-type PAMO does not show activity. At present, the research on PAMO is mainly focused on site-directed mutant wild-type PAMO, and a comparative study on the catalytic ability of M446G on earthworms. Structural analysis and catalytic mechanism studies found that the key amino acid site M446 located in the active center of PAMO is crucial for its ability to catalyze the formation of indigo. In this study, site-directed mutagenesis was used to mutate the M446 loci to prepare mutants. The catalytic effect of M446G on the quinones and the determination of their products were studied. In experiments, the natural substrate of PAMO, phenylacetone, was used as a model substrate to determine the catalytic activity of each mutant.

Keywords: Phenylacetone Monooxygenase Indigo Site-directed mutation M446G

目录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1 靛蓝 1

1.1.1 简介 1

1.1.2 来源与用途 1

1.1.3 意义 1

2 PAMO 1

1.2.1 PAMO的简介 1

1.2.2 PMAO的结构特点和活性位点 1

1.2.3 PAMO的酶学性质 2

1.2.4 PAMO的应用 3

3 M446G PAMO 3

1.3.1 简介 4

1.3.2 M466G催化吲哚生成靛蓝 4

1.3.3 M466G PAMO与M446G突变体的差异 4

1.3.4 M466G其他类似催化活性 4

4 定点突变技术 5

1.4.1 定点突变 5

1.4.2 应用 5

第二章 实验材料与设备 7

2.1 实验主要仪器 7

2.2 实验主要试剂 7

2.3 实验用菌株、质粒 8

2.4 实验中涉及引物 8

2.5 培养基 8

第三章 实验方法 9

3.1定点突变9

3.1.1设计引物 9

3.1.2 PCR反应 9

3.1.2.1 反应体系 9

3.1.2.2 条件 9

3.1.2.3 琼脂糖凝胶电泳 10

3.1.2.4 DpnI消化（去模板） 10

3.1.3 化学转化 10

3.1.4 挑单菌落 11

3.1.5 提取质粒 11

3.1.6 DNA质粒浓度检测与稀释 12

3.1.7 提质粒测序 12

3.1.8 甘油保菌 12

3.2 送测序 12

3.3 蛋白质的表达及纯化 13

3.3.1 蛋白质的表达及纯化 13

3.3.2蛋白凝胶电泳SDS-PAGE 13

3.4 生长细胞的筛选 14

3.4.1 接种活化 15

3.4.2转接 15

3.4.3诱导 15

3.4.4收集菌体 15

3.4.5全细胞催化 15

3.4.6样品处理 15

3.5 液相测谱仪的使用 15

第四章 结果与分析 16

4.1 质粒电泳结果与分析 16

4.2 M446G突变构件电泳结果 16

4.3 蛋白质表达SDS-PAGE结果与分析 17

4.4 液相测试催化活性 18

第五章 结论与展望 19

参考文献 20

致谢 22

文献综述

1.1 靛蓝

1.1.1 简介

靛蓝是一种有机颜料，广泛应用于印染，制药等行业。微生物法的使用引起了国内外学者的关注，由于与靛蓝合成相关的中间体和副产物的转化和合成仍不清楚，低本土产品受到其他微生物法的影响以改变这种情况。

1.1.3 意义

研究单加氧酶的分子改造用于靛蓝的制备将会是一个极大的进步，在染料生产等领域做出极大的贡献。

1.2 PAMO

1.2.1 PAMO的由来

1.2.2 活性位点、结构

通过X射线分析PAMO晶体结构（图2.2）。 PAMO在活性中间体中具有环状环，其是由441,442,443,444和Arg337之间的氢键组成的环状结构。（FAD区域具有较大差异，其活性中心具有LOOP环凸起）

PAMO催化剂位点位于晶体的表面并且可以在NADPH因子的帮助下刺激C-C链扩展并反应。常见的活动区域对应于野生型CHMO[1]。苯乙酸使用用于控制PAMO和CHMO并确定使用的PAMO，，实验结果表明突变体的是，R377，V54，I67，Q152和A435，其中R377是最活跃的区域。

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