文 献 综 述

1.当今社会现状

随着蔬菜中农药残留引起的食品安全问题的频发，农药残留的检测受到人们的普遍重视。而我国的农药年生产量居世界第三，但农药品种内部结构不合理，杀虫剂占农药总产量的70%。在70%的杀虫剂中，有机磷杀虫剂占70 %，其中高毒性的有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂又占有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的70%左右，因此最容易引起食物农药残留中毒[1]。

目前主要的检测方法有光谱法[2]、色谱法[3]和快速检测法即酶抑制法[4]，其中酶抑制法主要采用动物胆碱酯酶和植物酯酶。植物酯酶抑制法由于其酶源易得，提取和保存方便，检测成本低，测量准确度较好，可以满足有机磷农药残留检测市场化要求等优点，成为近年来有机磷农药残留快速筛选的研究重点 。基于酶抑制原理的快速检测技术[6]势将成为食品生产或产品销售时农药残留检测及控制的重点研究对象。

2.几种前人常用的方法

王仲海等[7]采用分光光度法对植物酯酶和动物酯酶在不同pH值下的酶活性、抑制程度等性质进行了实验研究，张宁[8]以及黄志勇等[9]比较了测定蔬菜中有机磷农药残留的胆碱酯酶抑制法和植物酯酶抑制法，通过正交试验优化了两种酶抑制法的测定条件，还有有机磷水解酶检测水解产物来测定有机磷农药的含量[10]。得出结论，植物酯酶具有酶源丰富、取材方便、成本低和保存方便的优势，而且农药的灵敏度和检出限与动物胆碱酯酶相当[11]，精密度甚至更好。

双水相萃取法[12]和硫酸铵沉淀法[13]是目前使用的较方便的俩种粗酶提取法,硫酸铵沉淀法较容易理解，所以我采用硫酸铵沉淀法来纯化小麦酯酶。

酶的化学修饰主要有俩种：一是改变酶分子的主链结构［14］，这种修饰属于分子生物学层次，又称理性分子设计，目前主要通过定点突变和酶法进行; 二是改变酶分子的侧链基团。目前的化学修饰研究基本上都是针对酶侧链的修饰，主要包括酶分子表面的非选择性修饰和分子内部特异位点的选择性修饰。酶的表面的非选择性修饰主要包括小分子修饰，大分子修饰（聚乙二醇修饰，多糖修饰）；分子内部特意位点的选择性修饰包括基因重组，定点突变。

3.我在试验中采取的几种化学修饰方法

在已有的酶修饰研究中，最常见也是最主要的化学修饰是大分子修饰，其主要利用大分子高分子量而且具有良好的生物相容性和水溶性，对一定基团或者化学键改变达到修饰的目的。

（1）肝素是聚阴离子水溶性酸性粘多胺聚糖类药物,以高分子蛋白聚糖的形式存在于动物体内，具有抗炎、抗粘附作用。从生物活性研究上看脱硫酸化肝素能不同程度地降低血小板与血浆蛋白和血纤蛋白原的黏附[15]。杨华利[16]用肝素与大蒜的SOD酶共价修饰，获得了高稳定性的SOD酶。

（2）右旋糖酐是一种天然的高分子多糖，具有良好的生物相容性和水溶性，是目前应用广泛的酶分子修饰剂之一，它由葡萄糖通过糖苷键连接而成，其多糖上的双羟基经活化后可与酶分子上的游离氨基共价结合，从而达到酶改性的目的。朱怡然17}利用右旋糖酐多糖上的双羟基经活化后可与酶分子上的游离氨基共价结合，从而达到酶改性的目的对savinase蛋白酶进行修饰{。修饰后的酶热稳定性提高，与底物的亲和力增强，且耐碱性有所提高。

（3）琥珀酸酐可以与赖氨酸残基的ε-氨基发生特异性修饰反应从而改变赖氨酸的结构{18]。李树白[19]利用酸酐对木瓜蛋白酶的进行修饰，获得修饰的木瓜蛋白酶热稳定性，耐碱性和耐洗涤性均有提高。

（4）聚乙二醇(PEG)是一种线性、无毒且不带电的水溶性大分子，分子末端有两个能被活化的羟基，活化的PEG修饰剂主要和酶蛋白分子表面的残留氨基相偶联。刘恩岐{20]利用活化的聚乙二醇与生姜蛋白酶表面残基相偶联的修饰。修饰后的生姜蛋白酶较原酶，热稳定性提高，但活性却降低了。右旋糖酐修饰的效果要好于聚乙二醇，因为其能提高蛋白酶的活性。

（5）金属离子在一定浓度对酶活性有影响，可以与酶的活性中心金属离子进行置换，常用的金属离子化学修饰剂有Mg 2 ，Ca2 和Fe 2 ，由于这三种离子往往是酶活性中心的激活剂，往往可以提供酶活。Chang-jun Hou等{21]的研究表明Ca² 和Mg ² 是植物酯酶的活性激活剂。

4.一般原理及未来

采用植物酶测定农药残留量的工作原理是依据农药能抑制植物酶的活性，能产生这种反应的农药包括有机磷农药和某些氨基甲酸酯农药。利用这一原理可以将小麦酯酶置于薄层色谱版、纸片或者试管中 ，使酶与式样进行反应，如果式样中没有农药残留或残留量极小，酶的活性不被抑制，基质可以水解，水解产物通过显色剂或本身具有颜色而显色；反之，如果农药残留量较高，酶的活性就会被农药所抑制，水解产物减少或没有产物生成，酶被抑制的程度又可用比色法来测定。然而由于小麦酯酶是小麦中分离乙酸萘酯等酯类的关键酶类，一旦被分离，酶分子结构的微环境往往会发生改变，从而影响酶活性部位氨基酸残基的电离状态，稳定性差而且活化作用受到影响。研究表明，酶的化学修饰在分子水平上对酶进行改造，即利用化学手段将大分子或者某些基团结合到酶分子上，改变酶的理化性质，这样可以快速，廉价的提高酶活性[22]。所以，我们可以根据常见的修饰试剂选择合适的试剂对小麦酯酶进行修饰，观测其结果是否达到可以提高小麦酯酶的稳定性和增进其催化活性，来找到几种方便快捷且廉价的化学修饰剂本文以小麦面粉为植物酯酶的提取原料，经过硫酸铵沉淀过滤得到粗酶液，通过对小麦酯酶加以化学修饰来提高酶活和酶的稳定性。

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40～42.

２．本课题要研究或解决的问题和拟采用的研究手段（途径）：

本实验研究的意义目的

有机磷类农药是我国使用量最大的一类农药，它们在提高农作物产量的同时却对人类健康和环境带来了潜在的危害，有机磷类农药的残留问题越来越引起了人们的重视。有机磷类农药传统的检测方法有气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱-质谱法等，因其技术含量高、仪器昂贵，前处理复杂、检测时间长、且需要特定的实验条件和具有一定专业技术人员进行操作。酶抑制法以其高灵敏度和高准确性及低成本等优势，已经得到广大使用者的认可，适用于我国国情。由于动物胆碱酯酶来源不便、保存条件困难，植物酯酶具有酶源丰富、取材方便、成本低和保存方便的优势，而且对有机磷农药的灵敏度和检出限与动物胆碱酯酶相当。本课题研究的主要目的在于从来源简便、低成本的小麦面粉中提取,纯化，冻干小麦酯酶，并对小麦酯酶加以化学修饰，从而得到更稳定，酶活更高的小麦酯酶,最终可以方便低价的检测农药，为让人们放心地吃的安全的蔬菜作出微薄的贡献。

本课实验研究的主要内容

(1) 利用小麦酯酶价格低廉，获取容易的特点，通过测定小麦酯酶粗酶液酶活，确定小麦酯酶的适宜的提取液。小麦酯酶粗酶液对有机磷农药的检出限，通过硫酸铵盐析纯化小麦酯酶粗酶液，并在冻干保护剂的条件下将其冻干制成酶粉，用分光光度法测定冻干小麦酯酶酶粉对有机磷农药的检出限。

(2) 主要做如下三类化学修饰:二价金属离子修饰，Mg2 ,Mn2 .Ca2 ,Zn2 ,Cu2 ,Fe2 。大分子修饰：右旋糖酐，肝素钠，聚蔗糖。修饰氨基酸：苯甲基酰氟，琥珀酸干，乙二胺四乙酸二钠等。然后找出最适的修饰剂及其对应浓度，以此作为工业生产中小麦酯酶的化学修饰剂。

(3)主要采用的是酶抑制法中的比色法来测酶活。有机磷和氨基甲酸酯类农药对特定酯酶的酶活具有抑制作用，其抑制率与农药浓度呈正相关，正常情况下，酶催化底物水解，水解产物可以与显色剂反应生成在一定波长下具有较强吸收的物质，当体系中有有机磷或氨基甲酸酯类农药存在时，酯酶酶活受到抑制，催化产物会减少，显色产物生成量也会减少。用分光光度计测定显色产物在最大波长下的吸光度，计算出抑制率，通过抑制率可以判断出样品中是否有有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在并确定其浓度大概范围。