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摘 要

黑色酵母状真菌(Black yeast)，分布广泛，其外形与酵母菌形状相似、体内可以产生并积聚黑色素，并且可以抵御多种恶劣环境的胁迫。本论文的目的是为了初步鉴定一种黑色酵母状真菌，确定它的生物分类学地位并且研究其抗逆特性。用PDA 固体培养基培养该实验菌株，在光学显微镜下观察菌株的微观形态，利用分子生物学方法对其LSU rDNA D1/D2 区基因进行克隆测序，并与基因库中已知序列比较，构建系统发育树进行分析，并进行了菌株的紫外线照射和NaCl 生长压力实验。结果表明，该实验菌株属于Aureobasidium 属菌，其核酸序列与已报道的A.pullulans v. subglaciale CBS 1233871的核酸序列聚在一个单独分支中，同源支持率为79%；并且该菌株具有极强的抗逆性。本实验运用传统形态观察法与现代分子生物技术相结合的方法初步确定了一种黑色酵母状真菌的生物分类学地位，为黑酵母的分类鉴定和进一步开发利用提供了材料和依据。

关键词：黑酵母；鉴定；系统发育；抗性

Preliminary Identification and Characterization of a Black Yeast - like Fungi

ABSTRACT

Black yeast (Black yeast), widely distributed, its shape and yeast shape similar to the body can produce and accumulate melanin, and can withstand a variety of harsh environmental stress. The purpose of this paper is to identify a kind of black yeast fungi, to determine its taxonomic status and to study its resistance characteristics. The microstructures of the strain were observed under the optical microscope. The LSU rDNA D1 / D2 gene was cloned and sequenced by molecular biology method. Compared with the known sequence in the gene pool, the system was constructed. The developmental tree was analyzed and the strains were subjected to UV irradiation and NaCl growth stress experiments. The results showed that the strain was belonging to the genus Aureobasidium and its nucleic acid sequence was clustered in a single branch with the reported A.pullulans v. Subglaciale CBS 1233871, and the homologous support rate was 79%; and the strain was extremely strong Of the resistance. In this study, the taxonomic status of black yeast fungi was determined by the combination of traditional morphological observation and modern molecular biotechnology, which provided the material and basis for the identification and further development of black yeast.

Key words: Black yeast; identification; phylogenetic; resistance

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1黑酵母概述 1

1.1.1黑酵母简介 1

1.1.2黑酵母的种类 1

1.2黑酵母初步鉴定的方法 2

1.2.1黑酵母的形态学鉴定 2

1.2.2黑酵母的生理生化特征鉴定 3

1.2.3黑酵母的分子生物学鉴定 3

1.3黑酵母的特性 6

1.3.1黑酵母的生态学特点 6

1.3.2耐盐及耐重金属特性 6

1.3.3耐辐射特性 7

1.4本课题的研究内容及意义 7

第二章 实验材料与方法 9

2.1实验材料 9

2.1.1 实验菌种 9

2.1.2实验试剂与仪器 9

2.1.3培养基 10

2.2实验方法 11

2.2.1菌株的培养及形态学观察 11

2.2.2 DNA的提取 11

2.2.3 LSU区的PCR扩增及克隆 12

2.2.4目的基因的回收 13

2.2.5 LSU区基因序列分析方法 14

2.2.6 耐UV射线辐照研究 14

2.2.7 耐盐特性研究 14

第三章 结果与讨论 15

3.1实验菌株的形态观察 15

3.1.1 菌株的菌落特征 15

3.1.2菌株的显微形态 15

3.2实验菌株的分子学鉴定 16

3.3实验菌株的特性研究 17

3.3.1菌株的耐UV射线特性 17

3.3.2菌株的耐盐特性 17

第四章 结论与展望 18

4.1结论 18

4.2展望 18

参考文献 19

致谢 21

文献综述

1.1黑酵母概述

1.1.1黑酵母简介

黑色酵母状真菌(Black yeast)，是与酵母菌形状相似的、细胞体内可以积聚黑色素的一类真菌，可存在于多种生活环境中。它们的细胞通常具有多种形态特点，可以用各种形式来表示，如具有隔膜的菌丝体细胞、芽生孢子、膨胀孢子、厚壁孢子和酵母样细胞等；其成长速度比较慢，由细胞体内的厚垣孢子产生并集聚黑色素，从而能够抵御许多恶劣的环境，如UV射线、渗透威胁和重金属毒性等^[1]。

从19世纪被发现至今, 国内外对黑色酵母状真菌的各项研究并不是十分充足。国际上对其研究起步领先于国内，而且获得了一部分的研究结果；国内对此类菌株的研究起步并不是那么早，不过最近几年内也获得了具有突破性的成果。在所有的这些黑酵母里面，短梗霉属扮演着举足轻重的角色，它们不只拥有不少特殊的抵御恶劣生存环境的能力，而且还能够产生许多十分有用的代谢产品，它所拥有的发展价值和应用前程是不可估量的，可在多功能生物制品领域有更多的发展^[2-3]。

1.1.2黑酵母的种类

当前，已经发现了分别属于42个属的黑色酵母状真菌菌株，对其中超过19个属进行的研究比较多，它们的主要种类特征见表1.1^[2-4]。

表1.1 黑酵母的主要种类

注： ：有；–：没有；*：在逆境中产生

1.2黑酵母初步鉴定的方法

1.2.1黑酵母的形态学鉴定

黑色酵母状真菌的菌体形态结构有酵母样细胞（Yeast-like）、分生组织样结构（Meristematic）、念珠状菌丝（Moniliod hyphae）、真菌丝（Hyphae）、假菌丝（Pseudohyphae）等多种类型。分生组织状结构是黑酵母的一种奇特的群体构造，在强酸性环境中生长的黑色酵母状真菌细胞内偶尔会出现这种结构。想通过传统的形态学方法初步确定菌种，就需要仔细观察其是否产生菌丝、菌丝的形态、有性孢子和无性孢子的类别。出芽生殖和产孢子是黑色酵母状真菌进行无性繁殖的两种办法，其中分生孢子包含横向分隔（例如Coniosporium 属）和纵向切隔（例如Trimmatostroma 属）两种多细胞分生孢子类型。而子囊孢子是黑色酵母状真菌的有性繁殖的重要形式^[4]。

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