1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

1.1 果酒

我国水果种植面积广、资源丰富、种类繁多、产量大，水果已成为继粮食、 蔬菜之后的第三大种植新产品^[1]。利用水果酿造果酒已成为解决我国水果过剩的重要途径。果酒的酒度低，酒质温和爽口，果香味浓，营养价值高，基本保持了水果中的天然营养成分，并且富含人体所需的各种氨基酸、多种维生素及矿物质。适时地饮用不仅能够补充人体所需营养物质、增加人体食欲、促进肌体消化代谢，而且还能够起到保健酒所具备的预防疾病、增进健康的作用^[2]。

许多研究发现，在果酒发酵过程中发酵温度对果酒风味的影响甚大。温度较高时会导致果香味挥发，氧化损失较大，同时会引起高级醇、挥发酸、醛类等副产物增加，使酒的风味劣化；另外，较高的发酵温度还使酵母迅速老化，造成后发酵困难，会招致乳酸菌和醋酸菌等杂菌迅速繁殖，其代谢产物会使果酒质量下降；相反，低温发酵会减少高级醇含量以及增加萜烯类和乙酸酯类等香气物质，从而提高酒的风味^[3-4]。然而，低温发酵也存在一些危害，如漫长的发酵周期，迟缓的发酵速率，甚至是中止发酵。目前大部分的研究都着重研究筛选出耐低温酵母或发现与耐性相关的基因, 并在此基础上进行了相应的基因工程操作, 提高酵母菌的耐性^[5]。

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

2.1 研究内容

（1）在苹果果汁原料中添加原始酵母、抗冻酵母AFY-1及市售酵母进行发酵，考察不同酵母的发酵性能。

（2）在不同温度下进行果酒发酵，找出固定化抗冻酵母AFY-1的优势。

2.2 实验材料

2.2.1 酵母

抗冻酵母AFY-1菌种（本实验室选育菌种）；原始酵母菌种。

2.2.2 实验试剂

海藻酸钠(分析纯),sigma公司；葡萄糖(分析纯)，汕头市西陇化工有限公司；氯化钙(分析纯)，汕头市西陇化工有限公司；蛋白胨（生化试剂），北京澳博星生物技术有限责任公司；酵母浸粉（生化试剂），北京澳博星生物技术有限责任公司。

2.2.3 实验仪器

THZ恒温振荡器，太仓市强乐实验设备有限公司；SW-CJ-ZD型双人洁净工作台，苏州净化设备有限公司；GZX-9140MBE型干燥箱；SHP-150型恒温箱，上海精宏实验设备有限公司；PHS-3C型精密pH计,上海隆拓仪器设备有限公司；SBA-40E型生物传感器，山东省科学院生物研究所。

2.3 实验方法

经种子培养、扩大培养制得抗冻酵母酵母泥。称量一定量的海藻酸钠，加适量水加热溶解，冷却后，用量筒定容，制得海藻酸钠溶液，加入一定量的酵母制得海藻酸钠-酵母细胞混合液悬液。称量一定量的无水氯化钙，加适量水溶解，用容量瓶定容，制得氯化钙溶液。将制得的海藻酸钠-酵母细胞混合液用蠕动泵滴入氯化钙溶液中造粒，固化一定时间。倾去上清液，用无菌水洗涤3次。取出颗粒自然干燥，存放于培养皿中，放置4℃冰箱备用。

2.3.1 不同固定化酵母的发酵性能差异

在苹果果汁中添加相同细胞数的固定化原始酵母、固定化抗冻酵母AFY-1及固定化市售酵母，调糖，在30℃的恒温培养箱中进行果酒发酵，在12、24、36、48、60h取样，测定果酒中的乙醇浓度、还原糖及总糖浓度、酸浓度。

2.3.2 温度对固定化酵母的发酵性能的影响

在苹果果汁中添加相同细胞数的固定化原始酵母、固定化抗冻酵母AFY-1及固定化市售酵母，调糖，在10℃、20℃、30℃的恒温培养箱中进行果酒发酵，在12、24、36、48、60h取样，测定果酒中的乙醇浓度、还原糖及总糖浓度、酸浓度。

2.3.3 测定方法

2.3.3.1 发酵性能的测定

发酵液中的乙醇浓度采用生物传感器（SBA-40E，山东省科学院生物研究所）进行测定。

2.3.3.2 总糖及还原糖浓度

（1）还原糖测试液的制备

取10mL果酒，放入试管中，于50℃恒温水浴中保温20min，作为测试液。

（2）总糖测试液的制备

取50mL果酒，放入试管中，加入6mol/L HCL 5mL，再置于80 ℃水浴锅保温30min，冷却后滴加2滴酚酞指示剂，以10%的氢氧化钠中和滴定至溶液呈微红色（滴定需谨慎突变点），定容至100 mL，作为测试液。

（3）样品中含糖量的测定

将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入20ml蒸馏水，摇匀，采用分光光度计测定在540nm处的吸光值。测定后，取样品的光吸收值在标准曲线上查出相应的糖量。

果酒中的还原糖和总糖含量按式(1)、式(2)计算：

还原糖（g/L） （1）

总糖（g/L） （2）

C：测试液的还原糖浓度，mg/mL；Vt：测试液体积（25mL）

2.3.3.3 酸浓度

果汁中的酸浓度采用酸碱滴定中和反应进行测定。

（1）配置0.1mol/L NaOH溶液100mL。

（2）取10mL果汁溶液进行酸碱滴定。

（3）果酒中的还原糖和总糖含量按式（3）计算：

酸浓度（g/L） （3）

V_NaOH：NaOH消耗的体积，mL