摘 要

白腐真菌在处理废水方面有着很显著的作用，除了菌丝球本身的吸附功能外，同时白腐真菌所产生的一系列酶类对染料废水中的物质也有一定的降解功能，基于这一原理，在本次研究中首先探究了孢子接种量对菌丝球的形成的影响，结果发现，当接种量小时形成的菌丝球比较大，但数量少，当接种量大时形成的菌丝球比较小，但数量多；同时也探究了孢子接种量对酶活大小的影响，结果发现，随着接种量的增加，酶活性会随之有一定程度的增加，但是接种量在达到一定程度后，酶活便会到达峰值，这时若继续增大接种量酶活便会开始下降。综上所述本实验中选择菌丝球比较均匀，且酶活最大的接种量，即孢子悬液为5mL来进行后续实验。在对结晶紫染料进行脱色的实验中，6小时的脱色率达到了60%，这证明了生物吸附和生物降解联用的优越性。而且数据显示在脱色开始的前两个小时的阶段中脱色率能够达到40%，这可能是生物吸附和生物降解联用之后吸附和酶解共同作用、相互促进的结果。

关键词：黄孢原毛平革菌；锰过氧化物酶；染料脱色

Abstract

White rot fungi play a significant role in the treatment of wastewater. In addition to the adsorption function of the mycelial pellet itself, a series of enzymes produced by the white rot fungi also have a certain function of degrading the substances in the dye wastewater. Based on this principle, in this study we first investigated the effect of spore inoculum on the formation of mycelial spheres. It was found that when the inoculum size was small, the mycelial spheres formed were large, but the number was small. When the inoculum size was large, the mycelium ball is relatively small, but the number is large. At the same time, we also explored the effect of spore inoculation on the size of the enzyme activity. It was found that with the increase of the inoculum size, the enzyme activity will increase to a certain extent, but after the inoculation reaches a certain level, the enzyme activity will reach a peak value. , if you continue to increase the inoculation amount of enzyme activity will begin to decline. In summary, the mycelial spheres were selected to be uniform in this experiment, and the inoculum volume with the largest enzyme activity, ie 5 mL spore suspension, was used for subsequent experiments. In the experiment of decolorizing the crystal violet dye, the decolo- -rization rate reached 60% at 6 hours, which proves the superiority of the combination of biosorption and biodegradation. Moreover, the data show that the decolorization rate can reach 40% in the first two hours of decolorization. This may be due to the joint action and mutual promotion of adsorption and enzymatic hydrolysis after combined biosorption and biodegradation.

Key words: Phanerochaete chrysosporium; Manganese peroxidase; Dye decolorization

目 录

摘 要 I

Abstract II

目 录 III

第1章 绪论 1

1.1研究背景 1

1.1.1染料脱色 2

1.1.2 优势与缺陷 3

1.2黄孢原毛平革菌和锰过氧化物酶 4

1.2.1黄孢原毛平革菌 4

1.2.2锰过氧化物酶(MnP) 4

第2章 材料与方法 6

2.1 材料 6

2.1.1实验试剂 6

2.1.2实验仪器 8

2.1.3 其它实验用具 8

2.2方法 8

2.2.1培养基与试剂制备 8

2.2.2实验过程 11

第3章 结果与讨论 15

3.1结果 15

3.1.1 接种量大小对菌丝球的影响 15

3.1.2 扫描电镜表征 15

3.1.3 锰过氧化物酶酶活大小及表达 16

3.1.4 生物量 17

3.1.5 培养液流变特性变化 18

3.1.6 生物吸附和生物降解对染料脱色的作用 19

3.2讨论 20

第4章 总结与展望 21

4.1总结 21

4.2展望 21

参考文献 23

致 谢 25

第1章 绪论

1.1研究背景

随着工业越来越快速的发展，经济的发展越来越快，随之而来的是一系列的环境问题，其中污水治理一直以来都是环境保护的核心问题之一，也是比较难处理的问题之一。一般情况下，工业产生的废水中通常含有许多处理起来比较难的物质，这些物质大大的增加了废水处理的难度。传统情况下的处理废水的手段包括的是物理方法和化学方法，如过滤、离子交换、溶剂抽提、高级氧化技术、活性炭吸附等^[1]。这些技术受到广泛的应用是因为其存在着一定的优点，例如物理法和化学法对特定的污染物的去除效率比较高，但同时也存在着一定程度上的缺陷，如化学药品的使用太多、仪器设备价格太高、操作成本太大以及适用范围有限等，这些存在的缺陷使其在应用上受到了比较大的限制^[2]。在这种情况下，生物处理法看起来更像是一种更为经济的处理方式，因为相比较于传统的物理化学方法而言，生物处理法中除了大量使用的活性污泥以外，还有一些相对复杂的生物方法也在慢慢的受到了重视，例如生物吸附法、生物降解法及生物吸附和生物降解联用的方法^[3]。其中生物吸附和生物降解联用的处理污水的方法的主要原理是利用微生物可以选择性吸附废水中的某些有害物质的能力，一些微生物还能产生一定的酶类，这些酶对有害物质进行不同程度的降解^[4]，从而达到处理污水的目的。工业中采用生物系统进行污水处理的主要原因是因为生物系统的低成本、节能、高效率，同时还可用于能源生产或用作肥料等有价值的最终产品的生产。生物反应器是应用于污水处理中常用的生物技术，一般情况下最常见的是细菌生物反应器，而真菌的使用却受到比较少的关注。但是在真菌生物反应器所具有的一些优点，例如真菌可以产生大量的生物降解酶，以及真菌具有抗恶劣环境的能力，特别是对污染物的负荷、低磷含量和低营养成分的耐受性，这些都说明使用真菌生物反应器是有利的^[5]。

目前应用于废水治理研究中的真菌主要是丝状真菌，因为大多数的丝状真菌如青霉菌、曲霉菌和木霉菌等，在特定的液体培养过程中，所产生的菌丝会在振荡过程中形成菌丝球，这可以看作是一种菌体自固定化的过程^[6]。菌丝球自身具有比较多的优点，如具有较强的生命力、较快的沉降速度、固液分离比较容易，重复利用性比较强等^[3]。近年来，关于丝状真菌的生物吸附功能在废水处理方面的应用的报道比较普遍，丝状真菌所具有的这种吸附作用不仅是活菌丝具备，已经灭活的菌丝体也具备^[7]，其原因在于大量的化学官能团广泛的分布于丝状真菌的表面和内部，因此即使菌体失活，只要官能团没有被破坏，那么菌体所具有的生物吸附功能就会一直存在，这种作用已经在实际的应用中得到了体现，如此看来丝状真菌所具有的生物吸附有一定的优越性，也许可以替代或加强传统的吸附工艺。另一方面由于大多数真菌能够产生很多的酶，其中有些酶对污染物有着比较强的降解能力，如漆酶、木质素酶等，因此对于活体真菌来说，在去除污染物时，除了能够利用生物吸附外，还可能包含一定程度的生物降解功能^[3]，因此可以利用菌丝球的生物吸附和生物降解联用的功能，将其应用于废水中的难降解物质的去除、进行染料脱色、重金属离子的吸附和去除其他有害物质等方面。真菌能够产生大量特异性和非特异性酶的独特能力使真菌对复杂的有机污染物的降解有着非常大的作用^[8]。不同的真菌菌株被用来去除有机污染物的三个主要群体：合成染料，广泛用于纺织、印刷和纸张行业，通常包含大量的COD、BOD、悬浮物，有毒化合物和颜色；酚类，主要出现在从制药废水，农药、溶剂、纸和纸浆工业；药物，即抗炎药、镇痛药、抗生素、精神科和抗癌药物。

对于染料废水来说，由于染料自身所带有的颜色可以看作是废水的第一特征，因此可以把脱色率看作是在含有染料的废水的处理过程中的一项重要的指标，来表示处理效果。对于一种特定的染料来说，选择不同物种的真菌菌丝对其进行脱色，其脱色率往往会有比较大的差异。例如青霉菌在实验条件下对染料活性黑的脱色率高达99%^[9]，而黑曲霉的脱色率只有88%，且需要更长的时间^[10]。这些结果在一定程度上就能够说明不同种类的真菌对于染料的脱色能力存在较大的差异。工业废水所含的成分不是单一的，可以说是很复杂的，一般往往含有各种浓度不一样的染料，同时还可能含有其他的有害物质，在这种情况下，能够在实际应用得到广泛的使用，且具备较大的潜力的是某些对多种染料都有较强吸附能力的真菌，而不是只能够吸附单一染料的真菌。

1.1.1染料脱色

染料本质上是一种合成有机物，广泛的存在于印染废水、纺织废水及造纸废水中，由于大多数合成有机物如染料具有较高的化学稳定性、光稳定性，因此含染料的废水也就成为了最难处理的污水之一，而且染料废水的工业排放量也是比较大的，仅纺织工业这一行业每年就会排出含染料废水至少1.5×10⁸m^3[11]。一般情况下，大多数的染料都具有致突变甚至致癌性，会导致人体的很多器官受到一定程度的损害，如肝脏、肾脏、中枢神经系统和生殖系统等^[12]，因此，含有染料的废水的处理虽是很困难的问题，但同时也是一个极为重要的问题。

近年来，真菌能够对染料进行脱色的功能越来越受到大家的关注，并在一系列的研究中发现真菌确实具有较强的吸附和降解染料的能力。在利用真菌对染料废水进行脱色的过程中，一方面主要是由于真菌在生长过程中可以产生乳壳等一系列具有较高降解能力的酶系，利用这些产生的酶对废水中的染料进行降解，另一方面，真菌的生物量也可作为去除有机化合物的良好的生物吸附剂，利用菌丝球表面和内部的官能团对染料进行吸附。在应用不同种类的真菌对染料废水的脱色进行了广泛的研究之后，发现真菌颗粒具有一种自适应特性，特别是白腐菌在染料废水的脱色中，菌体能够在连续的使用之后依然保持活性，同时能够有效地去除高浓度的染料。

现有大量的关于白腐真菌在染料废水的应用的研究，这些研究初步认为，白腐真菌对染料的脱色作用包括两个方面：生物吸附和酶促降解。其中酶促降解是指利用白腐真菌能够产生特殊的酶系，如锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶来催化氧化还原染料分子，使其不饱和共轭键被破坏，同时产生氧化性物质，在脱色和降解的过程中发挥作用^[13]。酶促降解的大致过程就是这样，不同的酶在一些细节上有一定的不同，如在染料废水的脱色过程中MnP的作用机理是，MnP是在白腐菌次生代谢过程中被合成的，在合成之后会被分泌到胞外，然后经H₂O₂的催化而引发一系列自由基链反应，染料经过氧化还原反应会发生脱色、降解以及矿化^[14]。

1.1.2 优势与缺陷

通过以上讨论可以看到，用丝状真菌来处理工业废水具有多种优点。其中包括：①成本低。生物原料一般情况下都容易获得，而且价格相对较低，同时生物体生存能力较高，能够重复利用，另一方面并不一定要利用专门培养的生物体，即使是一些废弃的菌体也是可以得到充分的利用。②高效性。对染料的吸附和降解的效果都是比较好的，即使在染料浓度特别低的废水中，其对染料的处理率也是比较高的。③选择性。不同的真菌对不同的污染物的处理效果不同，但真菌对特定的污染物的处理具有选择性，即使在废水中有各种各样的干扰物，真菌依然可以选择特定的污染物作为自己的清楚目标。④适宜反应温度多为常温。大多数的真菌的吸附反应在室温下效果最好，同时大多数真菌产生的酶在室温下的酶活最大，这就说明真菌对废水的处理可以在室温下进行，而不用进行升温或降温的步骤，这就大大的减少了能量的消耗。⑤可去除的污染物种类多。同一种真菌可以对不同的污染物进行去除，而且也可以利用多种真菌结合使用来去除污染物，这样下来可以出现许多不同的组合，另一方面来说现阶段对真菌的研究并不是十分的完善，还有很多没有被发现且被研究的真菌，因此真菌的应用潜力是十分巨大的。

然而在实际情况下，虽然真菌在废水处理中的应用有许多的优点，也具有十分巨大的潜力，相关的报道和研究也是比较多，但是真正在实际中的应用还是比较少的，尤其是应用于大规模的工业中更是少之又少，这也从侧面反映了利用真菌对废水进行处理还存在着一定的缺陷：吸附量不大，酶量较少。真菌在生长过程中会受到各种因素的限制，从而使形成的菌丝球数量受到限制，这使得吸附量不大；同时真菌所产酶的酶量比较少，这使得酶促降解效果比较小，不适用于染料浓度高的废水。处理成本高。有的时候真菌在利用的过程中，并不是直接使用，而是根据废水中的成分以及污染物的性质对菌体进行物理化学改造或生物修饰，这样使得成本大大的增大了。不易保存。丝状真菌的生物活性比较高，而且菌体含水量比较高，在保存的过程中会有水分脱出，保存时间过久后，产生的水分太多会导致菌体腐败，因此若使用丝状真菌的话，就要求实时的制备菌体，这就增加了使用难度。④使用工艺复杂。丝状真菌作为生物处理剂，自身也是具有柔软性、机械强度低等特性，因而若应用于废水的处理中，所要求的处理条件就会比较温和，如搅拌速率不应太快，水力冲击不宜过大等，这就反应器的要求比较高。

1.2黄孢原毛平革菌和锰过氧化物酶

1.2.1黄孢原毛平革菌

白腐真菌(White rot fungi)是存在于生物界的一类相对比较奇特的丝状真菌。一般情况下，它们对各种异生的物质都具有一定的降解能力，同时拥有独特的降解机制，也正因其奇特之处这么多年来一直受到许多行业的高度重视，也得到了大量的研究。在分类上，白腐真菌属于担子菌纲(Basidiomycetes)，腐生在树木或木材上，因为能够引起木质发生白色腐烂而得此名^[15]。其菌丝体为多核，少有隔膜，无锁状联合。多核的分生孢子常为异核，担孢子却是同核体，存在同宗配合和异宗配合两类交配系统^[16]。Phanerochaete chrysosporium即黄孢原毛平革菌，是广泛分布于北美的一类具有较强有机物降解能力和环境友好的丝状白腐真菌，也是常用的极具代表性的白腐真菌。在黄孢原毛平革菌的整个生长阶段中，木质素过氧化物酶的合成量要比锰过氧化物酶大得多，在木质素降解中起主要作用的也是木质素过氧化物酶^[17]，因此在各个方面得到了极大的应用，因此关于黄孢原毛平革菌合成木质素过氧化物酶的条件及在染料降解中的作用，已经有了大量的研究和报道，而锰过氧化物酶相关的报道较少.和木质素过氧化物酶相比，锰过氧化物酶的合成具有对氧分压的要求低，而氮源浓度范围宽等优点，而且当锰过氧化物酶单独作用同样可以降解多种不同结构的染料^[18]。

1.2.2锰过氧化物酶(MnP)

锰过氧化物酶(MnP)是最为普遍的木质素修饰过氧化物酶和糖基化的血红蛋白，分子质量通常为40～47kDa，等电点pI为4.2～4.9^[19]，由黄孢原毛平革菌在内部合成然后被分泌至胞外。与LiP类似，MnP也是胞外酶，是以血红素作为辅基的糖蛋白，但是二者之间也存在着比较大的区别，主要表现在Mn² 参与MnP的氧化还原反应，虽然MnP也生成酶的中间体MnPI和MnPⅡ，但是MnP只有在Mn² 存在的情况下才起作用，没有Mn² 参与，MnP将不能被还原成原酶。其催化机制是将Mn² 氧化成Mn³ ，Mn³ 再氧化其他物质，加入适量的硫醇或者脂质，不饱和脂肪酸及它们的衍生物能够提高MnP的酶活力^[20]。除了降解酚类物质之外，MnP还对非酚类物质具有强大的降解作用，即被视为脂类过氧化作用的过程。