文 献 综 述

一、前言

随着人们对食品领域安全的关注以及石油基富马酸价格的不断攀升，利用可再生生物质原料发酵法制备富马酸备受关注。探讨了通过改造大肠杆菌，发酵法制备富马酸的关键技术问题。根霉属被认为是最佳的富马酸生产菌。利用根霉菌发酵法制备富马酸的研究已逾半个世纪，主要有以下几个技术难点阻碍了产业化进程: ①根霉菌缺乏遗传操作工具，菌株定向改造难度大; ②根霉菌形态发育机制不明，发酵过程控制难; ③富马酸及其主要衍生物L-苹果酸、L-天冬氨酸的生产缺乏系统集成、工艺繁琐、成本高。

1985 年，Osmani 等提出了根霉菌产富马酸的”胞液途径”学说，成为目前的主流观点。他们认为少根根霉的胞液中存在一条完整的”TCA 还原途径”，丙酮酸羧化酶是该途径关键酶之一，它催化固定化CO₂与丙酮酸反应生成草酰乙酸，草酰乙酸在苹果酸脱氢酶的作用下生成苹果酸，苹果酸再在富马酸酶的作用下生成富马酸 。该途径是富马酸的主要途径，其中丙酮酸羧化酶的用更为重要，它起着固定CO₂的作用，这也是实际生产中富马酸对葡萄糖的摩尔转化率远高于100%的根本原因; 而线粒体内TCA 循环途径的主要作用是提供能量( ATP) 、还原力( NADH) 和中间代谢产物以供菌体生长。Kenealy 等通过生理生化研究，从不同方面证实了Osmani 等的观点，即胞液中的TCA 还原途径才是根霉菌积累富马酸的主要途径。1996 年，Wright 等通过14 C 同位素标记的方法构建了R．oryzae 的葡萄糖代谢模型，证明了胞内存在2 个独立控制的丙酮酸代谢池，一个存在于胞液中，用于合成乙醇、乳酸、草酰乙酸、苹果酸及富马酸等，另一个主要用于TCA 循环 。高产富马酸的根霉菌除了能生产富马酸外，还能产生其他低浓度的羧酸，如苹果酸、乳酸和柠檬酸等，某些条件下还可能会积累乙醇。乙醇、乳酸与富马酸的合成途径，甚至包括TCA 循环，它们之间在丙酮酸的分配利用上是一种竞争关系 。同时TCA 循环又为乙醇、乳酸及富马酸的合成提供能量及还原力，因此它们之间又是一种共存关系。这是一种矛盾共存体，需要在2 个丙酮酸代谢池之间寻求一种碳流分配的平衡，从而实现目标产物积累的最优化。

本课题旨在利用基因工程手段构建富马酸生产菌株，解决根霉菌发酵所带来的问题，实现富马酸的生产。

二、研究内容

2.1丙酮酸羧化酶的性质

丙酮酸羧化酶是一种生物素，依赖性多功能酶，位于丙酮酸代谢途径中的一个分支点上，是TCA胞质还原途径的关键酶，在中间代谢途径中具有重要作用。它催化丙酮酸转化为草酰乙酸，期间伴随ATP的分解，催化生成的草酰乙酸主要参与糖异生途径，TCA还原途径，同时需要参与回补TCA循环。各种丝状真菌如根霉属，在液体培养基中能过积累富马酸，L-苹果酸或草酰乙酸等有机酸，最重要原因之一就是细胞质中含有丙酮酸羧化酶，并具有较强的活力。

丙酮酸羧化酶由两个基因pyc1和pyc2编码的同工酶，具有相同的作用，并定位于胞质内。

2.2 米根霉菌株