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毕业论文网 > 文献综述 > 化学化工与生命科学类 > 生物工程 > 正文

固定化细胞发酵制备丁二酸的研究文献综述

 2020-03-09 15:52:16  

丁二酸,俗称琥珀酸,作为一种常见的天然有机酸,广泛存在于动植物和微生物中,许多厌氧微生物以丁二酸作为其能量代谢的主要末端产物。作为一种优秀的C4平台化合物,丁二酸可被广泛用于药物、精细化工产品以及可生物降解的聚合物前体,具有很大的市场潜力[1]。利用生物法转化可再生资源生产丁二酸,成本低,污染小,环境友好,且在发酵过程中可吸收大量的CO2用于菌株的代谢,能够有效减轻温室效应,这也是丁二酸生产有别于传统有机酸生产的一个重要特点[2]。生物法生产丁二酸的主要原料是葡萄糖和木糖等糖类物质[3],其来源广泛且价格低廉(玉米、废乳清、工业生产废料等),可以减少石油、煤等不可再生资源的消耗,大大缓解现今社会的能源短缺[4]

1.1 丁二酸发酵过程中存在的产物抑制

丁二酸发酵过程与乳酸、丙酸等有机酸发酵过程具有一定的相似性,在发酵过程中都会产生大量的有机酸产物和副产物,这些有机酸会对菌体的生长、产物的形成产生一定的抑制作用,从而降低生产效率。Lin[5]等研究了发酵产物对A. succinogenes130Z生长和丁二酸产率等的抑制作用,并提出了产物与菌体生长、丁二酸产生的动力学模型。该研究结果表明,该菌能够耐受葡萄糖和丁二酸钠的浓度分别达到158 g#183;L-1和104 g#183;L-1。CoronaO Gonz#225;lez[6] 等通过实验测定了葡萄糖及产生的混合酸对A. succinogenes130Z菌株的动力学参数的影响,并采用Jerusalimsky方程描述整个发酵过程中菌体的生长过程,得出的菌体生长的临界总酸浓度为22 g#183;L-1。Song H[7]等人描述了M. succiniciproducens厌氧发酵产丁二酸过程存在底物与产物抑制的动力学模型,采用一个临界总酸浓度来考察菌体对生长的抑制作用,当总酸浓度达到17.23 g#183;L-1时,菌体生长即开始衰亡。

1.2 丁二酸发酵过程强化进展

发酵培养主要分为分批培养、连续培养和半连续培养,在此基础上,根据具体发酵过程的特征,衍生出各种不同的培养方式。目前发酵法生产丁二酸主要以分批发酵和补料分批发酵为主。分批发酵可以获得较高的丁二酸浓度,但丁二酸生产效率较低;补料分批发酵可以获得相对较高的丁二酸浓度,且丁二酸生产效率也较高。半连续发酵可以在发酵过程中部分解除产物抑制程度,在保持相对较高的产物浓度时提高产物的生产强度。连续培养可以在消除产物抑制的同时获得较高的设备利用率及生产速率,但产物浓

度相对较低。表1总结了目前主要丁二酸生产菌株发酵合成丁二酸的工艺研究状况和不

同菌株不同工艺的发酵水平。

表 1 各种菌株工艺研究和发酵水平现状[8]

Strain; gene type

Culture mode

SAa concentration

/g#183;L-1

SA productivityb

/g#183;L-1#183;h-1

SA yield /g#183;g-1

Anaerobiospirillum succiniciproducens

Wild type

Batch fermentation

50.3

2.1

0.90

Anaerobiospirillum succiniciproducens

FA-10

Batch fermentation

34.1

0.8#8211;1.1

0.66

Actinobacillus succinogenes

130Z; wild type

Batch fermentation

69#8211;80

1.2#8211;1.7

0.68#8211;0.87

Actinobacillus succinogenes

FZ53

Batch fermentation

94#8211;106

2.0#8211;2.8

0.78#8211;0.82

Corynebacterium glutamicum

R; wild type

Fed-batch fermentation

23

3.8

0.19

Corynebacterium glutamicum

ΔldhA-pCRA717

Fed-batch fermentation

146

3.2g/L#183;h

92%

Escherichia coli SBS550MG/pHL413;

ΔadhE, ΔldhAiclR, Δack-pta::CmR pyc

Fed-batch fermentation

40.0

0.4#8211;1.2

1.05

Escherichia coli

HL27659k/pKK313;ΔsdhAB, ΔackA-ptapoxB, ΔiclRptsG, pepc

Fed-batch fermentation

58.3

1.1

0.56#8211;0.66

Escherichia coli

AFP111/pTrc99A-pycpflAB::CmR, ldhA::KmR, ptsG#8722;, pyc

Fed-batch fermentation

99.2

1.3

1.10#8211;1.17

Mannheimia succiniciproducens

MBEL55E; wild type

Batch fermentation

13.5

1.8

0.68

Mannheimia succiniciproducens

LPK7; ldhA::KmR,

pflB::CmR, pta-ackA::SpR

Fed-batch fermentation

52.4

1.8#8211;3.0

0.76

Actinobacillus succinogenes

wild type

Semi-continuous

fermentation

43.5

2.07

#8212;

Anaerobiospirillum succiniciproducens

Wild type

Continuous

fermentation

8.3#8211;14

0.4#8211;1.35

93%

Mannheimia succiniciproducens

MBEL55E; wild type

Continuous

fermentation

5.5#8211;10

1.03#8211;3.90

60%#8211;69%

生物反应过程的一个特点是反应底物和产物对反应过程通常存在抑制。为提高转化率,常采用反应和分离耦合技术或过程集成,提高生产效率。生物反应器与膜耦合形成的系统或设备通常被称为膜生物反应器(Membrane Bio-Reactor,MBR)。生物反应具有条件温和、选择性强及产物抑制动力学等特点,多数以液相为介质的反应体系。因此在反应系统中引入膜技术,生物反应器内可控制微生物的培养,同时利用膜组件将产物从体系中分离,成为目前从工程上强化生物过程研究中的热点。MBR与传统的生物反应器相比较,具有如下优点:

(1)为生物反应提供温和的条件,避免热敏性物质失活和其他的机械、物理和化学损坏;

(2)将生物催化、产物的分离、浓缩及生物催化剂的回收等操作步骤结合成一个操作单元,简化生产步骤;

(3)膜在反应过程中可以把产物不断地从反应体系中分离出来,消除或减轻产物抑制问题,提高产物得率和体积产率;

(4)可截留生物催化剂,使细胞或酶在高浓度下运行,提高反应速率和产物浓度,可重复利用酶或细胞,降低成本;

目前膜循环生物反应器在多种有机酸发酵过程中已经得到成功运用。如在制备乳酸方面,Xavier[9]等人考察了超滤膜循环生物反应器操作模式对乳酸发酵的影响,发现在反应-分离耦合发酵过程中,膜组件连续运转的分离效果优于间歇运转模式,从发酵体系中适当排放衰老细胞,可保持稳定的膜通量,乳酸的生产强度可达36 g/L#183;h,比传统的分批发酵、连续发酵分别提高了33倍和5倍。Jeantet[10]等人用单一的纳滤膜组件替代传统的微滤或超滤膜组件构建膜循环生物反应器发酵制备乳酸,半连续发酵44 h,乳酸产率达7.1 g/L#183;h。发酵制备丙酸方面,Colomban Agnes[11]等人构建的超滤膜循环生物反应器,以废乳清中的乳糖为原料进行连续发酵制备丙酸研究,并进行了中试,连续运转950

h,适时排除衰老细胞,菌体浓度维持在50 g/L,丙酸的生产强度可达1.2 g/L#183;h。Patrick[12]等人以甘油为原料发酵制备丙酸,将分批发酵与膜循环生物反应器连续发酵进行了对比,通过超滤膜的分离,连续运行250 h,培养液中的抑制性副产物乙酸浓度逐步降低至0.1 g/L,并保持至发酵结束,丙酸产率提高到1 g/L#183;h,比分批发酵提高了7.3倍。在发酵制备丁二酸方面,Kim[13]等人利用M. succiniciproducens MBEL55E KCTC 0769BP连续发酵制备丁二酸,丁二酸生产强度达到3.19 g/L#183;h,比分批发酵提高了2.8倍,丁二酸收率达到55%。Lee等人开发了一种内嵌膜的新型生物反应器并利用A. succiniciproducens ATCC 29305连续发酵生产丁二酸,最高菌体浓度可达6.50 gDCW/l, 丁二酸生产强度可以达到3.3 g/L#183;h,比间歇发酵提高了3.3倍。Isabelle[14]等人设计了一种包括膜、反应器和电渗析的装置,用该装置三阶段连续发酵生产丁二酸,丁二酸的产量达到了42 g/L,生产强度可达14.8 g/L#183;h,相比分批发酵分别提高了28倍和20倍。

但是膜生物反应器也存在自身的缺点,主要是反应过程中对膜的污染。在长期培养的过程中,膜的表面会被细胞碎片和微胶粒堵塞,这些物质存在于培养基中,降低了膜的渗透性。膜的再生过程较复杂,因为反向冲洗有一定技术困难(溶液往相反方向渗入)。Jeantet[15]等人直接采用单一纳滤膜组件构建膜循环生物反应器发酵制备乳酸实现了较好的底物与产物分离效果,乳糖的截留率可达97%,避免了碳源损失,但发酵液对纳滤膜的污染十分严重,膜通量迅速衰减,连续培养仅能维持44 h。

1.3固定化细胞发酵有机酸的研究进展

固定化细胞技术与传统发酵法相比,具有以下优点:①反应速度快,产率高;②可在高稀释度情况下操作而不致产生细胞流失现象;③可显著减少发酵液中的游离细胞数量,减少细胞对分离介质的污染。

目前固定化的方法主要有:吸附法、包埋法、交联法和共价结合法,各种固定化方法和载体都各有特点[16],见下表。

表2 各种固定化方法的比较

微生物细胞的固定化方法以包埋法和吸附法最为常用。包埋法是将微生物封闭在天然高分子多糖类或合成高分子凝胶的网络中,从而使微生物固定化.其特点是可以将固定化微生物制成各种形状(球状、块状、圆柱状、膜状、布状、管状等),但包埋法得的固定化微生物对传质有一定的影响.吸附法是将微生物细胞附着于固体载体上,微生物细胞与载体之间不起化学反应,并且具有操作简单、固定化条件温和、细胞活性损失小、载体可以反复使用等优点,所以被广泛应用和深入研究。目前固定化细胞发酵制备有机酸已取得多项进展,如采用内置式纤维床反应器固定米根酶发酵制备乳酸,乳酸收率达90%,生产速率增加至2.5 g/L#183;h [17];Suwannakham等人采用纤维固定细胞生产丁酸,生产速率达2.9 g/L#183;h[18];同样采用固定化方法结合补料分批发酵,丙酸的高强度生产速率可维持300h[19]。但天然纤维易被降解,不易填充,因此无机材料也可以通过改性增强对细胞的吸附能力,如一般细菌表面都带负电荷,若载体表面的正电位越高,则细菌越易在载体上附着生长,因此,可通过一定的表面改良技术,提高填料表面的止电性和亲水性,以加快生物膜的附着和形成,从而提高附着在载体上的生物量。

 

2. 结语

膜循环生物反应器是提高有机酸生产速率的有效手段,而细胞固定化可在保持细胞活力的同时减少游离细胞数量,通过对固定材料进行针对性改性可提高细胞的固定效率与稳定性,因此,如将两者结合起来可进一步强化丁二酸的生产效率,推进丁二酸的产业化研究。

参考文献

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丁二酸,俗称琥珀酸,作为一种常见的天然有机酸,广泛存在于动植物和微生物中,许多厌氧微生物以丁二酸作为其能量代谢的主要末端产物。作为一种优秀的C4平台化合物,丁二酸可被广泛用于药物、精细化工产品以及可生物降解的聚合物前体,具有很大的市场潜力[1]。利用生物法转化可再生资源生产丁二酸,成本低,污染小,环境友好,且在发酵过程中可吸收大量的CO2用于菌株的代谢,能够有效减轻温室效应,这也是丁二酸生产有别于传统有机酸生产的一个重要特点[2]。生物法生产丁二酸的主要原料是葡萄糖和木糖等糖类物质[3],其来源广泛且价格低廉(玉米、废乳清、工业生产废料等),可以减少石油、煤等不可再生资源的消耗,大大缓解现今社会的能源短缺[4]

1.1 丁二酸发酵过程中存在的产物抑制

丁二酸发酵过程与乳酸、丙酸等有机酸发酵过程具有一定的相似性,在发酵过程中都会产生大量的有机酸产物和副产物,这些有机酸会对菌体的生长、产物的形成产生一定的抑制作用,从而降低生产效率。Lin[5]等研究了发酵产物对A. succinogenes130Z生长和丁二酸产率等的抑制作用,并提出了产物与菌体生长、丁二酸产生的动力学模型。该研究结果表明,该菌能够耐受葡萄糖和丁二酸钠的浓度分别达到158 g#183;L-1和104 g#183;L-1。CoronaO Gonz#225;lez[6] 等通过实验测定了葡萄糖及产生的混合酸对A. succinogenes130Z菌株的动力学参数的影响,并采用Jerusalimsky方程描述整个发酵过程中菌体的生长过程,得出的菌体生长的临界总酸浓度为22 g#183;L-1。Song H[7]等人描述了M. succiniciproducens厌氧发酵产丁二酸过程存在底物与产物抑制的动力学模型,采用一个临界总酸浓度来考察菌体对生长的抑制作用,当总酸浓度达到17.23 g#183;L-1时,菌体生长即开始衰亡。

1.2 丁二酸发酵过程强化进展

发酵培养主要分为分批培养、连续培养和半连续培养,在此基础上,根据具体发酵过程的特征,衍生出各种不同的培养方式。目前发酵法生产丁二酸主要以分批发酵和补料分批发酵为主。分批发酵可以获得较高的丁二酸浓度,但丁二酸生产效率较低;补料分批发酵可以获得相对较高的丁二酸浓度,且丁二酸生产效率也较高。半连续发酵可以在发酵过程中部分解除产物抑制程度,在保持相对较高的产物浓度时提高产物的生产强度。连续培养可以在消除产物抑制的同时获得较高的设备利用率及生产速率,但产物浓

度相对较低。表1总结了目前主要丁二酸生产菌株发酵合成丁二酸的工艺研究状况和不

同菌株不同工艺的发酵水平。

表 1 各种菌株工艺研究和发酵水平现状[8]

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