论文总字数：23400字

摘 要

内切菊粉酶是一类能够水解β-2,1-D-果聚糖果糖苷键的水解酶,在一定温度下水解菊粉生成低聚果糖,目前低聚果糖已被广泛应用于食品和医药工业^[1],因此，近年来内切菊粉酶的研究受到越来越多的重视。

本论文对实验室购进的一株无花果曲霉产内切菊粉酶的液体发酵条件进行了研究,通过优化培养基和培养条件提高内切菊粉酶酶产量，并对该菌株所产菊粉酶的酶学性质进行了初步研究，论文的主要研究内容和结论如下：

1. 对菌株产内切菊粉酶的液体发酵条件进行了研究，采用单因素试验初步确定影响这株无花果曲霉产内切菊粉酶的各单因子的较优水平。优化后的发酵条件为:菊粉20.25 g/L、蛋白胨21.20 g/L、（NH₄）₂·SO₄5.3 g/L、NaCI 5 g/L、MgSO₄·7H₂O　0.5 g/L 、ZnSO₄·7H₂O 0.1 g/L，初始pH 6.0、接种量6%、装液量50 mL/250 mL三角瓶、培养温度30℃、培养时间48 h。在此条件下菊粉酶酶活达到158.44 U/mL。

2. 对菊粉酶的酶学性质进行了研究.实验结果表明：菊粉酶反应最适温度为60℃，最适pH为4.0，在60℃以下保温1 h仍具有75%以上的活性，在pH3.0~7.0的范围内室温保存1 h具有80%以上的稳定性；

关键词:无花果曲霉 内切菊粉酶 发酵条件 酶学性质

Fermentation conditions and Enzyme hydrolysis of Endoinulinase by Aspergillus ficuum

Abstract

EndoEndoinulinase are 2,l-β-fructanohydrolases which convert inulin , a polymer of fructose in β-2,1 linkage , to fructooligosaccharides at proper temperature . Thus , the use of microbial Endoinulinase has proposed as the most promising approach to obtain fructooligosaccharides . So the research on Endoinulinase has been receiving and more attention .

A strain of Aspergillus ficuum which produces Endoinulinase was Purchase by our laboratory. In this paper , we studied the optimization of fermentation parameters , the purification and properties of Endoinulinase from Aspergillus ficuum. The 　main　 research findings are as follows:

1.Based on the results of single factor experiments , we optimize the cultivation medium and the fermentation parameters , respeetively. The optimal levels of the main factors as follows：inulin 20.25 g/L，protose-peptone　21.20 g/L,（NH₄）₂SO₄ 5.3 g/L，NaCl 5 g/L ,MgSO₄•7H₂O 0.5 g/L，ZnSO₄•7H₂O 0.1g/L，initial pH 6.5， inoculum amount 6%，volume of medium　50 ml/250 mL erienmeyer flask，cultivation temperature 30 ℃with a fermentation time of 48 h . Under this condition , the enzyme activity value was　158.44 U/mL．

2.The optimal reaction temperature and pH were 60 ℃ and 4.0 respectively . The enzyme were stable under 60 ℃ within pH3.0~7.0 .

Key words: Aspergillus ficuum Endoinulinase Fermentation conditions properties

目 录

摘 要 I

Abstract 1

第一章 文献综述 1

前言 1

1.1菊粉酶简介 2

1.1.1菊粉酶 2

1.1.2菊粉酶的分类 2

1.1.2.1 按照菊粉酶的作用方式 2

1.1.2 . 2根据菊粉酶在微生物体内的主要分布 2

1.1.2.3 根据菊粉酶来源 3

1.2菊粉酶的研究现状 3

1.2.1 筛选高酶活、稳定性好的菌株 4

1.2.2进行诱变育种以选育高产突变株和去阻遏突变株 4

1.2.3产酶发酵条件及菊粉酶分离纯化的研究 4

1.2.3.1不同条件对微生物产菊粉酶的影响 5

1.2.3.1.1碳源的影响 5

1.2.3.1.2氮源的影响 5

1.2.3.1.3温度的影响 5

1.2.3.1.4 pH的影响 5

1.2.3.1.5金属离子的影响 6

1.2.3.2菊粉酶的分离纯化 6

1.2.4克隆并高效表达菊粉酶基因,构建基因工程菌 7

1.3菊粉酶的应用前景 7

1.3.1利用菊粉酶生产果糖和高果糖浆 7

1.3.2利用菊粉酶生产低聚果糖 8

1.3.3利用菊粉酶生产酒精 10

1.4本研究的主要内容 10

第二章 无花果曲霉产内切菊粉酶液体发酵条件的优化 11

2.1材料与方法 11

2.1.1材料 11

2.1.1.1菌种 11

2.1.1.2主要仪器与设备 11

2.1.1.3主要试剂 12

2.1.2方法 13

2.1.2.1培养方法 13

2.1.2.2 发酵培养基的优化 13

2.1.2.2.6接种量对菌株无花果曲霉产内切菊粉酶的影响 14

2.1.2.2.7温度对菌株无花果曲霉产内切菊粉酶的影响 14

2.1.2.2.8培养基初始pH对无花果曲霉菌株产内切菊粉酶的影响 14

2.2结果与讨论 14

2.2.1不同碳源对无花果曲霉产内切菊粉酶的影响 14

2.2.2菊粉浓度对无花果曲霉产内切菊粉酶的影响 15

2.2.3不同氮源对无花果曲霉产内切菊粉酶的影响 16

2.2.4蛋白胨浓度对无花果曲霉产内切菊粉酶的影响 16

2.2.5（NH4）2SO4浓度对无花果曲霉产内切菊粉酶的影响 17

2.2.6接种量对无花果曲霉产内切菊粉酶的影响 18

2.2.7温度对无花果曲霉产内切菊粉酶的影响 19

2.2.8初始pH对无花果曲霉产内切菊粉酶的影响 20

2.3.本章小结 20

第三章 无花果曲霉内切菊粉酶酶学性质的研究 21

3.1材料与方法 21

3.1.1材料 21

3.1.1.1菌种 21

3.1.1.2主要仪器、设备 21

3.1.1.3主要试剂 21

3.1.2方法 21

3.1.2.1培养方法 21

3.1.2.3内切菊粉酶的最适温度 21

3.1.2.4内切菊粉酶的温度稳定性 22

3.1.2.5内切菊粉酶的最适pH 22

3.1.2.6内切菊粉酶的pH稳定性 22

3.2结果与讨论 23

3.2.1内切菊粉酶活力测定 23

3.2.1.1 DNS试剂（3，5-二硝基水杨酸试剂）的配制： 23

3.2.1.2胞外内切菊粉酶活力的测定 23

3.2.1.3胞内内切菊粉酶活力的测定 24

3.2.2内切菊粉酶反应最适温度 24

3.2.3内切菊粉酶的温度稳定性 25

3.2.4内切菊粉酶反应最适pH 26

3.2.5内切菊粉酶的pH稳定性 26

3.3本章小结 27

第四章 无花果曲霉菊粉内切酶酶解工艺研究 28

参考文献 29

致 谢 30

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