论文总字数：19741字

摘 要

本文重点研究了糖基转移酶ZS4在大肠杆菌中的异源高效表达，经过考虑引物的选取，聚合酶链式反应（PCR）条件选择，从Bacillus licheniformis ZSP01中扩增了糖基转移酶ZS4目的基因片段，并提取质粒pET28a，DNA限制性核酸内切酶双酶切，DNA的琼脂糖凝胶电泳胶回收纯化，质粒DNA和目的DNA片段的连接及重组质粒DNA转化至大肠埃希氏菌。获得了糖基转移酶ZS4克隆菌株。

而后诱导表达，用SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量，并发现糖基转移酶ZS4在大肠中表达产物主要为包涵体。通过尝试优化糖基转移酶ZS4的诱导表达条件，如诱导剂种类，诱导剂浓度，诱导温度等，得出诱导温度对改善蛋白可溶表达的影响较为明显。但仍未获得较理想的蛋白可溶表达条件。影响蛋白可溶表达的条件的因素很多，除了转录效率的影响，mRNA二级结构，mRNA的稳定性，翻译以及翻译后折叠等，都是影响蛋白可溶表达的因素。希望在将来，分子生物学和蛋白质学学中蛋白质可溶表达这一难题能够被突破。

关键词：糖基转移酶ZS4，克隆，大肠杆菌，表达。

Glycosyl transferase ZS4 In E.COLI high expression of heterologous

Abstract

This dissertation focuses on the research of the heterologous glycosyl transferase ZS4expression in Escherichia.coli, through the study of primer selection, isolation of plasmid DNA, nucleic acid (DNA) electrophoresis, DNA restriction endonuclease analysis, DNA agarose gel electrophoresis, plasmid DNA and DNA sections and the recombinant plasmid DNA was transformed into the original nuclear cell,Escherichia.coli competent cell preparation and transformation countertransference ZS4 cloning. Then the SDS-PAGE determination of relative molecular mass of protein, transcriptional regulation, conversion of BL21 and induced the expression of glycosyl transferase ZS4 optimizing expression in e.coli.The inducing agent temperature obviously affect the protein soluble expression.

Key Words: glycosyl transferase ZS4 clone Escherichia.coli express

目录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1糖基转移酶的重要性 1

1.2 当今大肠杆菌中异源蛋白高效表达的常见方法 1

1.3 常见的诱导剂种类、温度、时间及相关案例 1

1.4 本工作的计划 3

第二章 糖基转移酶ZS4的克隆 4

2.1 实验材料 4

2.1.1试剂 4

2.1.2实验仪器 6

2.2实验内容 7

2.2.1引物选择 7

2.2.2 提取质粒DNA 8

2.2.3 核酸（DNA）电泳 8

2.2.4 DNA的限制性核酸内切酶酶切分析 9

2.2.5 DNA的琼脂糖凝胶电泳 9

2.2.6 质粒DNA与目的DNA片段的连接及重组质粒DNA转化原核细胞 10

2.2.7 大肠埃希氏菌感受态细胞的制备和转化 11

2.3 结果与讨论 12

第三章 糖基转移酶ZS4在大肠杆菌中的优化表达 14

3.1 实验内容 14

3.1.1 SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量 14

3.1.2 转化BL21及诱导表达 16

3.2 结果与讨论 16

第四章 结论与展望 19

4.1 结论 19

4.2 工作展望 19

参考文献 20

致 谢 21

第一章 文献综述

1.1糖基转移酶的重要性

糖基化是植物代谢过程中的一个重要的修饰反应.目标修饰物一般为二级代谢产物^[1]。一般情况下，糖基化反应是很多植物二级代谢产物(诸如黄酮类、氰醇类、甾体生物碱类和皂苷类)生物合成过程当中的最后一步^[2] 。现在，大概六千种不同类别的葡萄糖衍生物已被鉴定出来^[3]。糖基化发生在氧原子位（COOH-和 OH-），硫原子位（S-），氮原子位（N-）和碳原子位（C-），核苷酸上的活性糖基作供体^[4]。当前，引入糖基最主要依托化学合成和酶促反应两种方式完成。

1.2 当今大肠杆菌中异源蛋白高效表达的常见方法

一种高效的原核表达载体需要包含一个强大而且能够紧密调节的启动子；一个于翻译起始密码子5’端大约9bp的SD序列；在目的基因3’尾端的一个高效转录终止子。除此之外，载体须要一个复制起始点，筛选标识和利于对启动活性来严紧调节的基因。这类调节元件能够插入载体本身，也能够插入宿主的染色体。其他的元件包含转录和翻译增强子等。这些元件的功能往往具备基因特异性，所以应该按照不一样的情况加以舍取。虽然当前在大肠杆菌中表达外源基因方面已经有很多重大进展，但仍有很多问题亟待解决。

归纳起来主要有以下几点：

1.借助于细胞的分子伴侣机制来提高准确折叠的蛋白质的产量。可能能够通过共表达多种分子伴侣编码基因和通过激细胞内众多不一样的分子伴侣的办法来实现。

2.在大肠杆菌中表达真核膜蛋白和多亚基蛋白质复合物的困难上有待处理找到解决的办法。

3.蛋白质分泌到培养基中的有效机制应该清楚。当今有多种机制可以使重组蛋白质分泌到培养基中。当中有些是使用信号肽、融合伴侣和拥有穿透能力的因子，这类因子可以引发外膜的破碎和有限的渗漏。而另一个策略是利用现有的分析通道，来确保更高特异性的分泌。

4.给原核细胞像真核翻译后修饰的能力。比如糖基化，磷酸化，乙酰化和酰氨化^[5]。

1.3 常见的诱导剂种类、温度、时间及相关案例

蛋白质在大肠杆菌中的诱导表达β-半乳糖苷酶（IPTG），牛奶，糖和细胞外超氧化物歧化酶。在大肠杆菌中的异源蛋白的可溶性表达，诱导时间和诱导剂的量必须严格控制。在一般的低生物量浓度的观点引起的更合适，因为在对数生长期的细胞浓度低，活跃的生长，有利于可溶性蛋白的表达。然而，如果可以保证供给充分合理的通风，诱导的高表达可能在高浓度得到可溶性蛋白。人们普遍认为，在0.4 ~ OD600 0.6细胞浓度的影响，但是Margret B发现在OD600 0.5 ~ 2也可以得到更好的效果^[6]。

诱导剂种的类型和浓度都会对外源蛋白表达产生重要的影响，应根据所采用的表达系统和外源蛋白优化选择^[7]。目前，一般认为，在低浓度诱导高表达，在低温条件下，可以得到可溶性蛋白。温度为28~30℃可以避免不必要的蛋白构象改变，更易于菌体形成稳固的可溶性蛋白。然而培养温度下降并不能让全部外源蛋白的可溶性表达，这是由于某些外源蛋白在42℃时彻底可溶。所以不可以认为低温就可以使外源蛋白可溶性表达。

请支付后下载全文，论文总字数：19741字