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摘 要

1,4-丁二胺（1,4-diaminobutane）也被称为腐胺（putrescine），是生物活体或尸体中蛋白质的氨基酸降解产生的。1,4-丁二胺与己二酸的反应可用于生产棉纶尼龙-46。另外，它也是制备尼龙-6及尼龙-66的原料；可作为生物化学试剂、化学中间体及生化前导物；亦可作为酸性气体吸收剂。

NADH和NADPH是细胞重要的还原力，参与了一系列生物分子的合成过程，在具有这些代谢产物合成能力的菌株中，通过提高NADH和NADPH的供应，能促进产物的合成，优化菌株的性能。本研究构建在谷氨酸棒杆菌中诱导型表达NAD激酶基因ppnK和pos的重组菌株，在已有谷氨酸棒杆菌好氧产鸟氨酸的发酵工艺基础上进行摇瓶发酵实验。在好氧发酵36 h后，ppnK和pos的诱导表达菌的鸟氨酸产量（19.1±1.2 mM）和（17.6±1.1 mM）比出发菌株39#（14.6±0.9 mM）提高了30.8%和20.5%，说明通过表达ppnK和pos的基因来提高胞内NADPH的供应有利于鸟氨酸的积累。本研究为通过辅酶调控手段来提高胞内NADPH的供应，进而运用于氨基酸生产提供了一定的参考依据。

关键词：丁二胺，NAD激酶，转氢酶，谷氨酸棒杆菌

ABSTRACT

1,4-diaminobutane, or putrescine, which is an organic chemical compound, is produced by the breakdown of amino acids in living and dead organisms. The reaction between putrescine and adipic acid can be used to produce nylon-46. In addition, it is the raw material of nylon-6 and nylon-66. Putrescine can also be used as biochemical reagents, chemical intermediates, biochemical precursor substances and acid gas absorbents.

NADH and NADPH are important cellular reducing power, a series of biological processes involved in the synthesis of molecules, in the strain having the ability of these metabolites in the synthesis, by increasing the supply of NADH and NADPH, the synthesized product can promote and optimize the performance of the strain. This study builds glutamicum NAD kinase gene inducible expression of recombinant strains ppnK and pos conducted fermentation experiments have Corynebacterium glutamicum ornithine aerobic capacity on the basis of the fermentation process. In aerobic fermentation after 36 h, ppnK and pos bacteria induced expression of ornithine production (19.1 ± 1.2 mM) and (17.6 ± 1.1 mM) than the starting strain 39 # (14.6 ± 0.9 mM) improved by 30.8% and 20.5 %, and pos explained by gene expression ppnK to improve intracellular NADPH supply in favor of ornithine accumulation. This study coenzyme regulated by intracellular NADPH means to improve the supply of amino acids used in the production of further provide some reference.

Key words: putrescine, NAD kinase, transhydrogenase, Corynebacterium glutamicum

目录

摘要 II

ABSTRACT III

目录 IV

第1章 绪论 1

1.1 1,4-丁二胺简介 1

1.2 NADPH的供应渠道 3

1.2.1 通过PP途径补充NADPH 3

1.2.2 利用NAD激酶合成NADPH 4

1.2.3 NADPH 的其他供应方式 5

1.3 本文的研究目的和研究内容 6

1.3.1 本文的研究目的 6

1.3.2 本文的研究内容 6

第2章 材料与方法 8

2.1 实验材料 8

2.2.1 实验仪器 8

2.2.2 实验试剂 9

2.2.3 菌株与质粒 10

2.2.4 培养基及培养条件 10

2.2 实验方法 11

2.2.1 基因工程操作方法 11

2.2.2 主要的分析方法 12

第3章 结果与讨论 14

3.1 过表达PpnK和pos5的工程菌生长与葡萄糖消耗情况 14

3.2 过表达PpnK和pos5的工程菌的氨基酸积累情况 14

3.3 过表达UdhA和pntAB的工程菌生长与葡萄糖消耗情况 15

3.4 过表达UdhA和pntAB的39#工程菌的氨基酸积累情况 15

第4章 结论与展望 17

参考文献 18

致谢 23

第1章 绪论

1.1 1,4-丁二胺简介

多胺是一种在大多数活细胞中存在的物质。属于多胺的亚精胺或精胺可在不同物种例如细菌、真菌和动物中发现。1,4-丁二胺（或腐胺）是亚精胺或精胺代谢中的前体，可在革兰氏阴性菌或真菌中发现，它在不同物种中以很宽的浓度范围存在，表明其在代谢通路中具有很重要的作用。

1,4-丁二胺是多胺尼龙-4,6合成中的基本材料，通过1,4-丁二胺与脂肪酸的反应可生成多胺尼龙-4,6。1,4-丁二胺在加工塑料的生产中作为原料被使用，它通常通过包括丙烯转换为丙烯腈和琥珀腈的化学合成来生产得到。此化学合成由三步工艺组成，包括消耗大量能量的催化氧化反应、使用有毒化学品例如氰化物的反应以及使用高压氢气的加氢反应。通过化学合成生产1,4-丁二胺是不环保的，并且还会消耗大量能量导致石油资源枯竭。因此，需要开发涉及生物量利用的更为环保和高能效的方法来进行1,4-丁二胺生产。

在微生物中，1,4-丁二胺的生物合成途径与L-精氨酸生物合成途径中自谷氨酸至鸟氨酸的合成步骤相同。1,4-丁二胺可通过两条途径例如鸟氨酸脱羧或精氨酸脱羧进行合成。这两条途径生成了代谢所需的能量或使细胞获得了对氧化刺激的抗性。现已报道了一种通过转化大肠杆菌和棒杆菌以高浓度生产1,4-丁二胺的方法。大肠杆菌中1,4-丁二胺的生产可通过增加鸟氨酸脱羧酶和谷氨酸乙酰转移酶的表达水平来实现。此外，1,4-丁二胺可通过去除降解或使用1,4-丁二胺的亚精胺和乙酰腐胺合成途径以高浓度生产。同时，在缺乏1,4-丁二胺合成途径的棒状杆菌菌株中，1,4-丁二胺可通过插入来源于大肠杆菌的鸟氨酸脱羧酶基因自鸟氨酸生成，或是1,4-丁二胺可通过插入来源于大肠杆菌的L-精氨酸脱羧酶和凝集酶基因自L-精氨酸生成。鸟氨酸途径基本上可生产比L-精氨酸途径高大约50 倍量的腐胺。同时，发现大肠杆菌在44g/L 1,4-丁二胺存在下可正常生长，而谷氨酸棒杆菌在66g/L 1,4-丁二胺存在下可正常生长。因此，对于开发生产1,4-丁二胺的微生物来说，与大肠杆菌相比使用可在更高1,4-丁二胺浓度下生存的棒杆菌菌株似乎更为有效。

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