摘 要

Surfactin是一类脂肽类的生物表面活性剂，是迄今已报道的表面活性最好的生物表面活性剂之一。Surfactin还具有表面活性高，pH适用性广泛、耐热、耐盐、易降解等特点。此前有研究支链氨基酸代谢途径时发现，支链氨基酸对于surfactin的合成具有非常重要的作用。外源添加支链氨基酸不仅可以提高surfactin的产量，而且可以改变surfactin中脂肪酸的组分。我们发现分析支链氨基酸代谢流时发现，丙酮酸到支链氨基酸的过程中会形成中间产物α-乙酰乳酸，而α-乙酰乳酸会在ALDC(乙酰乳酸脱羧酶)作用下生成大量的副产物乙偶姻。此外，副产物乙偶姻（Acetoin,AC）的积累的产量高达8g,远远高于surfactin的产量，大大加重了代谢负担。因此本次论文主要内容是通过敲除乙酰乳酸脱羧酶（alsD）,下调乙偶姻的合成来观察支链氨基酸代谢流对于surfactin合成的影响。

关键词：Surfactin 支链氨基酸 乙酰乳酸脱羧酶 乙偶姻

Abstract

Surfactin is a kind of lipopeptide biosurfactant and it is one of the best surface active surfactants reported so far. Surfactin also has high surface activity, wide pH applicability, heat resistance, salt resistance, and easy degradation. Previous studies of branched-chain amino acid metabolism have found that branched-chain amino acids play an important role in the synthesis of surfactin. Exogenous addition of branched chain amino acids can not only increase the production of surfactin, but also change the composition of fatty acids in surfactin. We have found that when analyzing branched-chain amino acid metabolites, it was found that the pyruvate to branched-chain amino acid forms the intermediate α-acetolactate, and α-acetolactate generates a large amount of byproducts under the action of ALDC (acetolactate decarboxylase). Acetoin. In addition, the cumμLative production of the by-product Acetoin (AC) was as high as 8 g, which was much higher than that of surfactin, which greatly increased the metabolic burden. Therefore, the main content of this paper is to observe the effect of branched-chain amino acid metabolic flux on the synthesis of Surfactin by knocking out acetolactate decarboxylase (alsD) and down-regμLating the synthesis of acetoin.

Key words: Surfactin branched chain amino acid acetolactate decarboxylase acetoin

目录

摘要 2

Abstract 3

第一章 文献综述 6

1.1 引言 6

1.2 Surfactin的结构和理化性质 6

1.2.1 Surfactin的结构 6

1.2.2 Surfactin的性质 7

1.3 Surfactin的合成 7

1.4 Surfactin的应用 8

1.4.1 应用原理 8

1.4.2 Surfactin的应用领域 8

1.4.3 Surfactin在石油行业的应用 9

1.4.4 Surfactin在其他方面的应用 9

1.5 Surfactin的研究现状 10

1.6 选题支链氨基酸的意义及具体实施方案 10

第二章 分析方法的建立(HPLC) 12

2.1 引言 12

2.2 实验仪器与材料 12

2.2.1 实验仪器 12

2.2.2 实验材料 12

2.3 Surfactin实验分析方法 13

2.4 有机酸分析（乙偶姻 2-3丁二醇 乙酸） 13

3.1 引言 16

3.2 仪器与试剂 17

3.2.1 菌株和质粒 17

3.2.2 工具酶和试剂 17

3.2.3 主要仪器 18

3.2.4 引物表 18

3.2.5 培养基 19

3.2.6 主要溶液配方 19

3.3 双抗性标记无缝敲除alsD 19

3.3.1 敲除位点上下游目的片段扩增与连接 19

3.3.2 枯草感受态的制备 20

3.3.3 Bacillus subtilis s1 感受态转化方法 21

3.3.4 整合片段的构建及筛选 21

第四章 支链脂肪酸代谢流对Surfactin的改造结果 23

4.1 引言 23

4.2 实验仪器及材料 23

4.2.1 实验仪器 23

4.2.2 实验材料 23

4.3 双抗性标记无缝敲除alsD对Surfactin和乙偶姻产量的结果 24

第五章 结论与展望 27

5.1 结论 27

5.2 展望 27

参考文献 28

第一章 文献综述

1.1 引言

脂肽（Lipopeptides）是由微生物产生的一类生物表面活性剂（biosurfactant），由亲水的肽链和亲油的脂肪烃链两部分组成，按其结构特征大致可分为环状脂肽（cyclic lipopeptides，CLPs）与线性脂肽两类^[48]。表面活性素（surfactins）是芽胞杆菌合成的环脂肽类主要家族之一，其余还包括伊枯草菌素（iturins）家族、丰原素（fengycins，芬介素）家族等^[1]。

表面活性素(surfactin)是一类脂肽类的生物表面活性剂，surfactin具有很好的稳定性，而且具有很高的表面活性，surfactin由日本学者Arima在枯草杆菌Bacillus subtilis IFO3039发酵液中首次发现，是目前报道的最好的生物表面活性剂之一^[2]。 因此，surfactin也是目前研究最热门的生物表面活性剂。surfactin的生产菌株主要是枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌等^[3-4]。发酵生产surfactin主要的碳源为葡萄糖，其次为甘油，氮源主要有酵母粉、牛肉膏、硫酸铵等^[4-5]。Surfactin的产量低，生产成本高，成了阻碍其应用的最大瓶颈^[2]。

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