摘 要

质粒具有稳定性强且操作简单的优点。随着当今生活节奏的加快，当今社会人们患病的可能性越来越大，但康复率却不尽如人意，很多家庭因此变得支离破碎，生活不堪重负，基因合成成为目前一些疑难杂症治疗的有效手段。本文主要讲述p-deltaICP47基因的合成，载体的连接，感受态细胞的转化，阳性克隆的筛选，重组质粒的构建几个过程，并在此基础上克隆出基因序列，同时探索基因合成的便捷方法。通过基因的全合成实现基因的分子改造和人工组建，这也成为实验室的一种常规手段。

1.2.1重组质粒构建的目的 ………………………1

1. 2.2重组质粒构建的方法 ………………………1

1.3大肠杆菌 ………………………1

1.4目的基因与载体的连接与转化 ………………………2

1,4,1 酶切反应 ………………………2

1.4.1 连接反应 ………………………2

1.4.2 转化过程 ………………………2

• 1. 筛选阳性克隆 ………………………2
     1. 菌落PCR ………………………2
     2. 阳性克隆的筛选 ………………………3 1.6 质粒抽提 ………………………3

1. 3.3目的基因与载体的连接与转化 ………………………9 2.3.4阳性克隆的筛选 ………………………10

第三章实验结果与展望 ………………………12 3.1实验结果 ………………………12

1. 1.1PCR扩增结果 ………………………12

3.1.2回收电泳结果 ………………………12

3.1.3退火结果 ………………………12

3.1.4连接结果 ………………………13

3.1.5 平板长斑结果 ………………………13

3.1.5菌落PCR反应结果 ………………………14

3.1.6测序结果 ………………………14

本实验是对携带目的基因的质粒进行构建，首先进行p-delta-ICP47全基因的序列合成，根据PCR原理扩增所需要的基因，并对扩增出的目的基因进行凝胶回收，然后对回收后的产物进行连接转化，即将扩增出的目的基因导入PUC57载体，转化到大肠杆菌中，让平板在合适的环境中生长10小时，待平板生长完全后，观察平板的长斑情况，再通过菌落PCR来筛选所需要的阳性克隆，就是直接以单菌落为模板进行PCR扩增，根据扩增出的目的条带的大小，初步判断克隆是否正确，为了确保所筛选的阳性克隆完全正确，需要对该克隆进行测序验证，若测序结果符合要求，则已经获得目的基因片段，只需选择好适当的克隆，确定好重组方案，最后对ＤＮＡ片段之间进行体外连接，即可获得重组子。此重组子可转入相应的宿主菌中，用于对目的基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因工程药物的生产），还可用于序列分析和转基因等重要生物技术的研究中。

1.2 重组质粒构建的目的与方法

1.2.1重组质粒构建的目的

重组质粒构建的目的是为了建立获得简便、可靠的目的基因序列的方法。有目的基因，有质粒，然后用重组酶使两者相连接就能够得到重组质粒。

1.2.2重组质粒构建的方法

构建质粒的基本元件：a.启始复制子：使质粒在宿主细胞中能够复制；b.抗性基因：用于筛选阳性克隆；c.多克隆位点：插入外源基因。应用菌落pcr法对转化菌进行筛选和DNA序列分析。首先从基因序列的设计开始，到初步pcr扩增，将扩增所得目的基因导入目的载体中，经连接转化等步骤，使其在显色培养基上生长，通过蓝白斑筛选，挑取阳性克隆，将筛选出的阳性菌落通过送测至测序部进行序列比对、分析，获得最终想要的正确质粒克隆。

1.3大肠杆菌

大肠杆菌是我们实验室经常要用到的细菌，是原核生物，属于革兰氏阴性菌，具有运动性能，细胞壁很薄，代谢类型为异氧厌氧型，大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。

1.4目的基因与载体的连接与转化

1,4,1 酶切反应

使用限制性内切酶，内切酶的产物可以是粘性末端的（3'或5'突出端），也可以是平末端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上,以防止其失去活性，酶是最后一个被加入到反应体系中的（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。

1.4.1 连接反应（将纯化后的PCR产物与目的载体进行连接）

连接反应是基因合成实验中的重要操作步骤，操作质量关系着后续工作的顺利进行。因此，按照细则规范连接操作，从而使基因合成顺利进行。酶切片段可以与对应酶切线性化好的载体直接进行连接反应。PCR 产物因为5’端没有磷酸基团，PCR产物之间不能直接进行连接；但与相应的线性化好的载体可以进行连接反应。

连接过程注意事项：一般最后加入T4 DNA连接酶，T4 DNA连接酶用完应及时放回-20冰箱保存（！）。

1.4.2 转化过程（将连接产物转化到受体菌TOP10中，涂板，培养过夜）

转化是经过一些特殊方法将外源重组体导入受体细胞(主要为TOP10)，使宿主获得新的遗传性状。通过宿主细胞的生长使基因得以复制。DNA分子转化分以下几步:1．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸粘附于受体菌表面；2．转入－－42短时间热击处理促进细胞吸收DNA复合物；3．自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制；4．表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂，转录翻译。注意：在进行转化操作前，事先对超净工作台进行紫外灭菌30min，然后再进行此项操作。

1.5 筛选阳性克隆

1.5.1 菌落PCR

菌落PCR原理：直接以单菌落为模板进行PCR扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳判断阳性克隆，根据扩增出目的条带的大小，初步判断克隆是否正确。

1.5.2 阳性克隆的筛选

筛选是整个基因合成中重要的一步，筛选的目的是为了在连接转化的平板上，通过菌落PCR筛选出阳性克隆，得到含有目的片段的菌株进行测序，降低生产成本。本次实验采用的筛选方法为菌落PCR。由于本次实验操作的菌株是大肠杆菌，属于革兰氏阴性菌，细胞壁很薄，DNA很容易释放出来，而PCR的检测很灵敏，因此只需要一点点的模板就能够扩增出条带，从而我们选择使用菌落PCR，这是一种快速高效的检测方法。

1.6 质粒抽提

1.6.1 质粒抽提的目的

抽提质粒DNA，目的是最大限度的去除RNA、蛋白质、基因组DNA、脂质类物质、细胞碎片等杂质，为后面实验做好准备。

1.6.2 碱裂解法

4 TaqMan探针荧光PCR法定量检测水中大肠埃希氏菌方法建立和应用 3.7%（263） 胡朝友(导师：傅春玲) - 《苏州大学硕士论文》- 2014-04-01 是否引证：否 5 120305541122_周远睿_基因敲除的pcr鉴定 3.7%（263） 周远睿 - 《大学生论文联合比对库》- 2015-05-05 是否引证：否

6 正文周远睿 3.7%（263）

- 《大学生论文联合比对库》- 2015-05-14 是否引证：否

1. PCR技术简介 3.7%（263）

何燕,旦巴,卓嘎,孟霞 - 《西藏科技》- 2005-11-25 是否引证：否

1. 五味子甲素对粪肠球菌毒力因子作用的初探 3.7%（263）

崔红(导师：许颖) - 《佳木斯大学硕士论文》- 2015-06-06 是否引证：否

1. DNA聚合酶与引物/模板的相互作用对PCR效率的影响 3.7%（263）

杨奇奇(导师：黄强) - 《复旦大学硕士论文》- 2013-11-16 是否引证：否

1. 光学核酸分子探针信号放大策略用于生化分析的研究 3.7%（263）

刘沛(导师：羊小海;王柯敏) - 《湖南大学博士论文》- 2014-06-01 是否引证：否

1. 石油降解菌的筛选及生物学特性研究 3.7%（263）

杨智(导师：陈吉祥;李克生) - 《兰州理工大学硕士论文》- 2013-04-19 是否引证：否

1. 王璞 3.1%（222）

王璞 - 《大学生论文联合比对库》- 2014-05-24 是否引证：否

1. 基于酶放大的核酸检测研究 3.1%（222）

胡立慧(导师：朱俊杰) - 《南京大学硕士论文》- 2014-05-25 是否引证：否

1. 盐酸贝那普利对早期糖尿病大鼠足细胞Podocalyxin表达的影响 3.1%（222） 王艳(导师：任伟) - 《安徽医科大学硕士论文》- 2012-03-20 是否引证：否
2. 现代分子生物学研究方法综述 2.8%（201）

马尧;孙占学; - 《生命科学研究》- 2005-12-30 是否引证：否

1. 中国人结直肠癌中APC、P53、K-ras和PIK3CA基因突变的研究 2.5%（180） 陈曦(导师：贾雪梅;王明荣) - 《安徽医科大学硕士论文》- 2012-04-01 是否引证：否
2. 可降解生物医用镁合金JDBM作为颌骨修复材料的应用研究 2.3%（162）

官星旻(导师：袁广银) - 《上海交通大学硕士论文》- 2015-02-01 是否引证：否

1. 载脂蛋白B基因3′VNTP的多态性与冠心病关系的研究 2.0%（142） 车艳苓;丑广程; - 《大家健康(学术版)》- 2012-10-25 是否引证：否
2. 光纤型定量PCR仪荧光检测系统研究 1.8%（129）

钟珂珂(导师：陈章位) - 《浙江大学硕士论文》- 2013-01-01 是否引证：否

1. 1，嗜热α-葡萄糖苷酶的克隆表达，纯化及特性研究；2，抗菌肽的稳定性研究 1.5%（110） 陆禄(导师：史锋) - 《浙江大学硕士论文》- 2008-05-01 是否引证：否
2. 短乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达 1.5%（107）

范恩宇(导师：梅乐和) - 《浙江大学硕士论文》- 2010-05-10 是否引证：否

1. 实时PCR仪荧光信号监测系统的研究 1.2%（88）

刘娟容(导师：陈章位) - 《浙江大学硕士论文》- 2011-01-01 是否引证：否

1. Thermotoga neapolitana β-1，3-葡聚糖酶基因的克隆与表达 0.8%（60） 刘琼(导师：陈晓平;李大军) - 《吉林农业大学硕士论文》- 2013-06-01 是否引证：否
2. 动物源性食品中各种动物源性肉及肉制品鉴别检验的研究 0.6%（44）

吕二盼(导师：张伟;周正) - 《河北农业大学硕士论文》- 2012-05-20 是否引证：否

1. 高中生物学教学涉及的酶的种类、作用及应用 0.5%（36） 欣向宏; - 《生物学教学》- 2009-08-08 是否引证：否 原文内容 第二章实验材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验试剂：

DNTP，缓冲液，灭菌水，DNA聚合酶，T4连接酶，限制性核酸内切酶，引物，LB培养基，大肠杆菌细胞（TOP10），溴酚蓝，检测胶回收胶，凝胶回收试剂，抗生素PCR胶回收纯化产物（或酶切产物），PUC57载体，重组酶（CloneEZ

Enzyme）,液体质粒、感受态细胞、灭菌的LB培养基、对应抗性的固体LB培养基。

2.1.2实验器材：