1. 研究目的与意义（文献综述）

1.1 壳聚糖的概述

壳聚糖（chitosan，cs）是一种天然高分子碱性多糖，是甲壳素的n-脱乙酰基产物^[1]，如图1-1。两者之间无严格界限，通常认为甲壳素脱乙酰度达到50%以上就可称之为壳聚糖，且脱乙酰度越高，相对稳定性越差，但生物相容性和机械强度都会加强^[2]。壳聚糖可溶于盐酸、醋酸以及部分有机酸，不溶于稀硫酸、磷酸、水以及碱性溶液等^[3,4]。壳聚糖分子链上丰富的氨基和羟基可使其制备众多衍生物，在改善其水溶性等一系列性能的同时，也拓宽了壳聚糖的应用范围，在医药、环保、食品、化妆品、分离膜材料以及生命科学、功能材料等领域成为新的研究热点^[5]。

1.1.1 壳聚糖的生物学特性

2. 研究的基本内容与方案

1.了解羧丁酰壳聚糖以及羧丁酰壳聚糖-胶原蛋白肽的制备方法和机理；

2.合成羧丁酰壳聚糖接枝胶原蛋白肽，并选择适宜的改性方法；

3.以氧化普鲁兰为交联剂，形成水凝胶；

4.测定水凝胶的相关性能，并进行结构表征。

具体实验流程：

羧丁酰壳聚糖的制备：将5g壳聚糖溶解在200mL的5%的乙酸溶液中，充分溶解后移至三口烧瓶中，再加入400mL甲醇，机械搅拌15分钟后，加入15g丁二酸酐，常温下反应24h，加入15g的NaOH使其固体物又重新溶解，然后进行过滤，将得到的固体物溶解在蒸馏水中，透析3-4天，真空干燥得到羧丁酰壳聚糖。

羧丁酰壳聚糖-胶原蛋白肽：将一定量制备好的羧丁酰壳聚糖溶解在PBS中，纯化后的转谷胺酰胺酶和胶原蛋白肽分别溶解在50mL配置好的PBS中,将三者混合于250mL的三口烧瓶中，在一定温度下持续搅拌反应一段时间，反应结束后将反应液置于沸水浴中搅拌15分钟使酶失活，冷却后，将溶液pH调至中性，离心，离心后的清液经透析、干燥后得到羧丁酰壳聚糖-胶原蛋白肽。

优化方案：以取代度（DS）为标准，选取时间（A）、温度（B）、PH（C）、比例（D）进行正交试验设计：

正交表L₉(3⁴):

取代度的测定：

NSC-COP的取代度采用紫外分光光度法测定。首先，绘制胶原蛋白肽溶液浓度和吸光度的标准曲线。称取一定量的胶原蛋白肽溶解配置成不同浓度（0.001-0.05 g/l）的溶液，用紫外分光光度计在固定波长220 nm处测定其吸光度。得到的数据绘制成标准曲线，如公式（2-1)。再将不同反应条件下制得的NSC-COP溶于水配置成0.05 g/l的稀溶液，相同波长处测定溶液的吸光度值，参照标准曲线得到样品所含的胶原蛋白肽的浓度。最后，根据羧丁酰壳聚糖的取代度及分子量算出NSC-COP的取代度与胶原蛋白肽浓度的关系，如公式（2-2），利用此公式得到相应的取代度。

公式（2-1）

公式（2-2）

氧化普鲁兰的制备：5g普鲁兰多糖溶解于500ml蒸馏水中，充分溶解后，将其移至1000mL的三口烧瓶中，然后加入2.15g高碘酸钠。将混合溶液在避光条件下连续搅拌24h，然后加入5mL乙二醇以除去未反应完的高碘酸钠，加入后再将混合物搅拌1h，反应液经透析3-4天后，真空干燥得到氧化普鲁兰多糖。

水凝胶的制备：将优化配方后的羧丁酰壳聚糖/胶原蛋白肽溶于PBS(PH=7)中配制成5wt%的溶液，将氧化普鲁兰溶于PBS(PH=7)中配制成5wt%的溶液。取2mL羧丁酰壳聚糖/胶原蛋白肽溶液，加入不同体积的氧化普鲁兰溶液，搅拌均匀后静置得到羧丁酰壳聚糖/胶原蛋白肽/氧化普鲁兰复合水凝胶。

水凝胶性能测试：

凝胶时间：采用试管倾倒法测试水凝胶的凝胶时间。分别取一定量的样品注入10 mm直径的玻璃管内，同时开始计时，倾斜或者倒转试管，样品停止流动的时间即为水凝胶的凝胶化时间。

溶胀率：室温下将直径为 20 mm，厚度为10 mm 的水凝胶样品置于 PBS 缓冲液（PH=7.4）中浸泡 48 小时直到水凝胶达到溶胀平衡，在固定的时间间隔内取出溶胀的水凝胶，用滤纸将水凝胶样品表面多余水分完全移除并称重，按下式计算水凝胶溶胀率，其中，SR（%）为水凝胶的溶胀度，Ws为水凝胶溶胀后的重量，Wd为水凝胶初始重量，每组实验重复三次。

SR=（Ws-Wd）/Wd*100%

水蒸发率: 将直径为20 mm，厚度为10 mm 的水凝胶样品置于蒸馏水中浸泡至溶胀平衡，称重，将溶胀的水凝胶样品放置于温度为50℃、相对湿度为50%的真空干燥箱内干燥 24h，定期测量水凝胶的重量直至水凝胶完全干燥，按公式计算水凝胶的水蒸发率，其中，W1为水凝胶初始重量，W2为定期测量的水凝胶的重量，W3为水凝胶最终的重量，每组实验重复三次。

水蒸发率=（W1-W2）/（W1-W3）*100%

3. 研究计划与安排

2019.3.1-2019.3.15：查阅相关文献资料，明确研究内容，了解研究所需的原料，工艺方案确定，撰写开题报告；

2019.3.15-2019.4.5：选择适宜的接枝方法，确定羧丁酰壳聚糖-胶原蛋白肽的制备工艺；

2019.4.5-2019.5.8：以氧化多糖为交联剂，形成水凝胶；

4. 参考文献（12篇以上）

[1] tajima m, izume m, fukuhara t, et al. development of new wound dressing composed of n-succinyl chitosan and gelatin[j]. 生体材料, 2000, 18:8-14.

[2] liu x, peng w, wang y, et al. synthesis of an rgd-grafted oxidized sodium alginate–n-succinyl chitosan hydrogel and an in vitro study of endothelial and osteogenic differentiation[j]. journal of materials chemistry b, 2013, 1(35):4484-4492.

[3] wang t, zhou y, xie w, et al. preparation and anticoagulant activity of n-succinyl chitosan sulfates[j]. international journal of biological macromolecules, 2012, 51(5):808-814.