摘 要

随着人们大力度开采利用矿产资源，重金属污染土壤的情况越来越严重，影响到地球生态系统，威胁我们生存的生态环境，阻碍社会经济的可持续发展，因此土壤修复技术的探究具有重要意义。本论文以人工配置的铜污染土壤作为研究对象，以紫花苜蓿为铜污染土壤修复的富集材料，通过基质模拟铜污染培养实验中植物表型、对氮和铜的吸收量、光合作用等指标的测定分析，研究铜胁迫条件下，接种抗铜根瘤菌对紫花苜蓿在表型、光合作用及物质吸收等效应的影响，以期为根瘤菌-紫花苜蓿共生体系应用于重金属污染土壤的修复提供合理的理论依据。主要研究结果如下：

（1）在低铜浓度时接种根瘤菌对紫花苜蓿的株高根长没有明显的促进作用。接种根瘤菌促进植物生物量的增加，尤其是根部促进作用十分明显。接菌紫花苜蓿生物量在200 mg·kg^-1的时候最高。

（2）接种根瘤菌会明显的促进植物根系对土壤中铜的吸收，在铜浓度为200 mg·kg^-1时铜吸收量最高为24.19ug/株。

（3）接种根瘤菌会促进紫花苜蓿叶绿素和总氮的含量。在铜浓度为400 mg·kg^-1的时候接种根瘤菌的叶绿素增加效果最明显提高了44.5%。植物地上、地下部分植物的氮含量在铜浓度升高时会受到抑制，接种根瘤菌后明显促进植物根部对 N 营养元素的吸收，最高提升36.5%。

（4）接菌处理会增加紫花苜蓿地上以及地下部分富集系数。接种根瘤菌会降低紫花苜蓿的转移系数；高浓度的铜也会抑制紫花苜蓿根部向地上部分转移铜。但是接菌处理会提高紫花苜蓿地下部分的富集能力。

关键词：紫花苜蓿；根瘤菌；铜胁迫

Abstract

With the heavy mining and utilization of mineral resources, the situation of heavy metal contaminated soil is becoming more and more serious, seriously affecting the earth's ecosystem, threatening the ecological environment of our survival and hindering the sustainable development of the social economy. Therefore, the exploration of soil remediation technology is of great significance. In this study, the artificial copper contaminated soil was used as the research object. The enrichment material of the remediation of copper contaminated soil was made with alfalfa. The plant phenotype, the absorption of nitrogen and copper, photosynthesis and so on were measured and analyzed. The effects of Alfalfa on phenotypic, photosynthesis and material absorption are expected to provide a reasonable theoretical basis for the application of Rhizobium - alfalfa symbiotic system to the remediation of heavy metals contaminated soil.The main results are as follows:

(1) Inoculation with Rhizobium at low Cu concentration did not significantly promote root length of alfalfa. Inoculation with Rhizobium increased plant biomass, especially root promotion. The biomass of Medicago sativa was highest at 200 mg·kg^-1.

(2) Inoculation with Rhizobium could obviously promote the uptake of Cu by soil by plant roots. The highest copper uptake was 24.19ug/ strain at 200 mg·kg^-1 Cu.

(3) Inoculation with Rhizobium could promote the content of chlorophyll and total nitrogen in alfalfa. When the copper concentration was 400 mg·kg^-1, the effect of inoculation with Rhizobium increased by 44.5%. The nitrogen content of plants on the ground and underground parts of the plant was inhibited when the concentration of copper was raised. After inoculation of Rhizobium, it obviously promoted the absorption of N nutrient elements in plant roots, up to 36.5%.

(4) Inoculation could increase the enrichment factor of Alfalfa on the ground and underground. Inoculation with Rhizobium could reduce the transfer coefficient of alfalfa. High concentration of copper also inhibited the transfer of copper to the roots of alfalfa roots. However, the enrichment of Alfalfa underground could be enhanced by inoculation.

Keywords：Alfalfa；Rhizobium；Copper stress

目录

摘要 I

Abstract II

1绪论 1

1.1土壤重金属污染现状 1

1.2土壤重金属污染的危害 1

1.2.1 对植物的危害 2

1.2.2 对人类的危害 2

1.2.3对动物的危害 3

1.3重金属污染土壤修复技术 3

1.3.1物理修复 3

1.3.2化学修复 4

1.3.3生物修复 4

1.3.4微生物-植物联合修复技术 5

1.4研究意义和内容 6

2材料与方法 7

2.1供试材料 7

2.2实验内容 7

2.3测定方法 8

2.3.1植物表型性状的测定 8

2.3.2植物铜含量的测定 8

2.3.3 植物组织全氮含量的测定 8

2.3.4植物叶绿素含量的测定 9

2.4数据处理 9

3结果与分析 10

3.1接种根瘤菌对紫花苜蓿生长的影响 10

3.2接种根瘤菌对紫花苜蓿生物量的影响 11

3.3接种根瘤菌对紫花苜蓿铜吸收量的影响 13

3.4接种根瘤菌对植物叶绿素含量的影响 15

3.5接种根瘤菌对紫花苜蓿吸收氮的影响 16

3.6接种根瘤菌对紫花苜蓿转移系数和富集系数的影响 18

4 结论 20

5展望 21

参考文献 22

致谢 25

1绪论

1.1土壤重金属污染现状

人类自身的活动和社会工业的发展，导致重金属污染土壤的状况日益加剧，土壤环境重金属污染问题已成为当今社会进行环境保护工作的焦点。土壤重金属污染来源只要是城市生活、农业和工业三个方面^[1]。工业上，电子、电镀化工、采矿冶炼等产业所产生的三废没有经过处理直接进入土壤；农业方面，农田里施用的化肥农药，污水灌溉还有家禽牲畜的粪便施用使重金属进入土壤污染环境；城市方面，城市废污水，含有重金属的废弃物没有经过处理直接进入土壤，会对土壤造成污染。还有日常生活中的汽车产生的尾气也是土壤重金属的污染来源，它不仅仅会造成温室效应。目前我国汽车保有量达到2.6亿辆，汽车尾气中含有大量的铅，使得汽车尾气成为土壤重金属污染的巨大来源。汽车尾气中的重金属以气溶胶的形态扩散到大气中，造成了大气污染然后经过沉降进入土壤，污染土壤环境。

我们国家的耕地资源很少，而且面积还不断减少，所以土壤环境的问题日益受到重视，土壤环境安全问题不仅仅关系着植物微生物还严重影响着动物和人类的健康问题。目前我们国家受重金属污染的土壤区域越来越大已经超过了10万km²这大多数集中在经济结构发展比较完善的地区。我国土壤中Pb、Cu、Zn 、Cd 等重金属的污染越来越严重，含量早已超过土壤能自我修复的阈值，被污染的面积逐年扩大，威胁人类的生命健康和生态系统。据报道，自 2008 年以来，我国已发生大约百余起重大的土壤重金属污染事件^[2]。根据我国家土壤环境保护部门和国土资源部2014年共同发布的相关文件显示，我们国家的土壤环境状况特别不好，污染问题十分严重，面积逐步扩大，尤其是重金属污染更是重中之重。工矿业废弃土壤，土壤质量下降问题十分突出。根据我国相关部门调查分析我国多个地区，近 548 万 hm²土壤共320 个重点污染区土壤的相关报告显示，有 近11%的大田农作物种植土壤污染超标，尤其是铜、铅、镉汞及其联合污染特别严重^[2]。

1.2土壤重金属污染的危害

土壤重金属污染具有金属羟基化合物常剧毒、毒性会在人体内积累、相同金属不同价态会有不同毒性、金属形态多样、迁移性、可逆性、有机态毒性大于无机态，微生物不可以降解而且把重金属有机化，增强重金属毒性、属于缓冲性污染、产生毒性作用的浓度范围低等特点^[3]。土壤重金属污染对生态系统中的人类动植物都会造成伤害。

1.2.1 对植物的危害

土壤中的超标重金属会对植物的生长和生物量有很大的影响，土壤中的重金属会被植物根部的木质部组织以离子的形态从土壤中吸取，这种情况的主要原因是重金属与一些植物必需元素的性质相似，会采取共质体与非原质体的途径到达植物木质转运系统^[4]。被吸取的重金属会参与植物的正常代谢和生命活动，破坏植物代谢机制，并与植物体内物质产生生化反应，产生有害物质，阻碍植物吸收营养物质，遏制植物生长发育。重金属会让植物生长过程中的光合作用速率下降，减缓叶绿素合成。植物体内的重金属还会造成水分胁迫，使得植物根部木质部减少，抑制细胞增长，使植物部分气孔关闭，降低叶片蒸腾速率，使叶片相对水分含量降低。重金属具有排它性，植物内部积累的重金属会排斥其他重金属在植物体内积累，比如重金属 Cd 会对小麦生长有影响。在小麦的幼苗期小麦吸收提取土壤中的Cd会通过小麦的代谢过程进入小麦的茎叶，使小麦对Mg、Ca、 Fe和 K 等矿物质营养元素的吸收受到妨碍，从而导致小麦对着些营养元素的吸收降低，严重阻碍小麦的生长。植物可食用部位重金属积累会对以植物为食的生物产生危害。重金属元素有必需元素有 Mn、Fe、Cu和Ni、Zn 等，和非必需元素，必需元素对生物的生命过程有很重要的作用，比如蛋白电子传递以及和其它的酶共同协作等。而必需元素超标对于植物来说伤害更大，因为必要元素能够参与到植物各个生命活动中，伤害的途径要比非必要元素多的多。而一些非必要元素并没有参与到植物生理活动，比如Hg、Cd、Pb等。植物对抗重金属胁迫是通过基因的表达以及分子机制^[5]。所有的重金属都会导致氧自由基的产生。然而非必要元素通过抑制各生理活动以及对重要蛋白造成胁迫以及分子结构。

1.2.2 对人类的危害

土壤中的重金属进入人体一般是通过食物链，不同的重金属元素在人体内会造成不同的伤害。Cd 在内积累会造成体内器官的衰变，直接影响人体骨骼，导致骨质疏松；Pb进入人体，随着Pb含量在体内大量积累会导致肾功能的衰变，影响人的生殖功能，导致免疫力低下等。Cu 作为一种微量必需元素，当过量的铜在人体肝脏内积累时会导致“肝痘”等铜代谢疾病；Cr 元素的富集对人体皮肤和呼吸道甚至整个呼吸系统造成炎症，严重的会使呼吸系统粘膜溃烂等 ^[6]。

因此，为了保证人体的健康，使其免受土壤中重金属的毒害，应该从源头治理，保证食品的健康，保证植物体内没有超标的重金属，这要求我们应该积极做好重金属污染土壤的修复工作，保证植物绿色健康的生长，避免重金属通过动植物进入人体内。

1.2.3对动物的危害

土壤重金属污染对土壤中的动物会造成直接或者间接伤害，土壤重金属污染可以破坏动物的生殖系统降低繁育能力从而对土壤动物繁衍造成很大的影响。比方以生活在土壤中的蚯蚓为例^[7]，通过对重金属污染土壤中生物数量的多样性分析，在正常金属含量的土壤中的蚯蚓数量远远高于重金属含量高的土壤中的蚯蚓数量。同时高含量的重金属会降低土壤生物的多样性。因此，可以说重金属污染土壤直接影响土壤生物的生命活动，同时还会伤害土壤生物的繁殖能力。

1.3重金属污染土壤修复技术

目前社会的生态问题越来越远严重，人们也越来越重视环境生态问题，土壤环境受重金属的污染问题也受到了前所未有的重视。解决土壤环境问题不仅仅要从来源解决，比如控制工业和生活上的重金属污染排放，还要研究发展相应对策土壤修复技术来修复已经受到重金属污染的土壤。

现在学者们研究修复受污染土壤的技术主要从两个方面考虑，一是活化去除^[8]，即使重金属离子活化一次性去除土壤中的过量重金属，达到彻底清除重金属污染土壤的危险的目的；另一方法则是通过有效手段是重金属在土壤中的转化、迁移活性降低，使其生物有效性下降，就是固化法。按照土壤修复的原理，重金属污染修复技术主要有：物理修复如深耕翻土法、去表土还有传统的换土客土；化学修复包括淋洗等；生物修复有几种方法包括微生物修复、植物修复以及动物修复还有农业生态修复如使作物种类发生变化、改变耕作制度、调节土壤水分等等^[9]。

1.3.1物理修复

物理修复有很多具体的形式，考虑方面不同技术不同，目前考虑更多的是重金属存在的位置问题，对于重金属与土壤的作用、重金属本身或与其他成分之间的作用考虑的比较少。（1）大多数重度污染区的土壤使用传统的换土、客土法，而深耕翻土方法大多被应用于轻度污染的土壤，但是深耕翻土工程量大而且花费高还会打乱土体结构造成二次污染。（2）电动修复法是一种高效周期比较短的原位修复，重度污染区域会使用原位修复技术。电动修复技术是把电场直接作用于存在于土壤中的重金属离子，使离子发生迁移现象，从而把金属与土壤相互分离，达到修复土壤的目的。但是该技术的可控性不好，而且因为使用电场的原因会受到土壤导电性和含水率等理化性质的影响，比如此技术在沙质土壤中的处理效果就不好。（3）热处理是通过载气加热土壤，分离出土壤中的金属离子并使其进入气体处理系统。本方法的能量耗费比较大，回收汞蒸气的效果差，并且会容易产生二次污染。

1.3.2化学修复

化学修复技术就是向受污染的土壤中添加一些化学修复试剂，经过一些化学方法和反应如吸附、沉淀、萃取、氧化还原作用来固化或者活化土壤中的重金属离子，达到修复的目的。化学修复又可以按照原理和形式分为不同的方法。（1）稳定固化就是向受污染的土壤中加入相关药剂（如生物炭、高分子聚合材料、金属氧化物、有机质等），把存在于土壤中的重金属固定在固体结构里，降低重金属生物有效性。此方法容易受到土壤理化性质影响较大，固化剂价格较高。（2）淋洗萃取 / 萃取技术就是用水或者一些化学冲洗助剂比如天然有机酸、表面活性剂等冲洗土壤，去除土壤中的重金属离子，从而达到修复土壤的目的。但是该植物修复技术投入资金较高，治理费用高，还容易污染地下水资源，是土壤理化性质改变。（3）改良技术就是通过添加碳酸钙、沸石化学药剂等物品到重金属污染的土壤中，使重金属经过化学反应如吸附沉淀和氧化还原作用来降低重金属生物有效性或达到重金属的转移的目的。但是该这个技术会有二次污染的危险并且会破坏土壤内的微生物系统结构。

1.3.3生物修复

生物修复就是通过调控生物体的生命代谢活动来利用生物吸收、分解和转化土壤中重金属，使其含量降低和降解毒性。目前，生物修复有几种类型，分别为以下三种：（1）植物修复技术即利用植物的固定、吸收、提取、转化等过程来达到降低甚至去除土壤中的重金属污染物。植物挥发、固定，根际圈的生物降解还有植物萃取等技术都属于植物修复技术。其中，培育超富集植物的应用效果十分显著，它属于植物萃取的类型。相关研究也比较多，也有具体的实例。比如，当前开发出的一种新的修复土壤重金属污染的植物蜈蚣草。（2）动物修复技术就是利用在土壤中生活的动物比如说蚯蚓在土壤中的生理活动来对土壤中的污染物进行化解、消化，最终实现降低或消除土壤重金属污染物。（3）因为重金属的难降解性，微生物修复技术则是通过微生物对重金属的迁移和钝化来实现的。

生物修复技术因为其原位修复直接利用自然界中的生物来进行土壤修复，受到了学者们的广泛关注。没有物理修复中的庞大工程量，也不需要和化学修复技术一样加入各种化学修复试剂，生物修复只需利用在特定调控下自然界中不同系统间的相互作用就可以达到修复的目的。但是单单利用一种生物进行修复，还会受到某些特定因素的影响，所以目前有大量研究如何促进生物修复的效率。

1.3.4微生物-植物联合修复技术

联合修复技术是指结合两种及两种以上的修复方法进行污染土壤的修复，提升土壤修复的速度和效果，有效避免单项修复技术中的不足。微生物/动物-植物联合修复即利用根际强化和菌根生物等技术降解、吸收土壤中的有机污染物，是研究土壤修复技术的关键方向。植物 - 微生物联合修复通过促进植物将吸收的重金属转化为易挥发性气体，加速植物蒸腾作用有效提高植物挥发作用，增强植物的吸收能力和对重金属的耐受性^[10]。

根际微生物可以提高植物对于重金属的耐受性^[11]。根际是理化性质受到植物根系影响的一部分土壤区域，它处于植物根部附近。根际促生菌是一类能显著影响土壤理化性质，防止植物病虫害、促进植物的生长发育和新陈代谢作用以及缓减外界胁迫的存在于植物根系周围或植物根细胞内的有益微生物的总称。如果根际促生菌长期生长在重金属污染的土壤中，它的微生物代谢功能、群落结构和多样性等会遭到重金属的影响。菌体经过长期的适应性进化会是自身形成对应的抗性机制，如重金属甲基化作用、自身外排系统、氧化还原作用、生物吸附以及生物淋滤等来使自身受重金属的伤害降低。当然，在重金属的胁迫条件下，根际促生菌大多是通过各种抗性机制的协同作用来减轻重金属的毒害。