摘 要

近年来，骨骼肌肉疾病频发，采用组织工程技术治疗效果显著。

本文首先利用乳化交联法制备明胶微球，再制备透明质酸、明胶微球复合支架，探究制备支架的最佳配比及最佳微球粒径，并对支架进行测试表征。

研究结果表明，制备明胶微球时，随着制备温度的升高，明胶微球的粒径变小；高速搅拌有利于更小明胶微球的形成。当透明质酸的含量越高，明胶微球粒径的增加，所得支架的溶胀比、气孔率、降解率增加，抗压强度减小。当透明质酸：明胶微球=0.35:0.15（质量比）时所制备的支架的综合性能最佳，作为透明质酸/明胶微球支架的最佳明胶微球粒径为30 μm。

关键词：透明质酸；明胶微球；溶胀比；气孔率；降解率；抗压性能

Abstract

In recent years, skeletal muscle diseases occur frequently, and tissue engineering is effective in the treatment of skeletal muscle diseases.

In this paper, gelatin microspheres were prepared by emulsification and cross-linking method, and then hyaluronic acid and gelatin microspheres composite scaffolds were prepared. The optimum ratio and particle size of the scaffolds were investigated, and the scaffolds were characterized.

The results showed that the particle size of gelatin microspheres decreased with the increase of preparation temperature, and high speed stirring was beneficial to the formation of smaller gelatin microspheres. When the content of hyaluronic acid increased and the particle size of gelatin microspheres increased, the swelling ratio, porosity and degradation rate of the scaffolds increased, and the compressive strength decreased. Hyaluronic acid: gelatin microspheres = 0.35 ：0.15 (mass ratio) was used as the best ratio of the scaffolds, and 30 μm was selected as the best particle size of the scaffolds.

Key Words：Hyaluronic acid; Gelatin microspheres; Swelling ratio; Porosity; Compressive property

目录

摘 要 I

Abstract II

第1章 绪论 1

1.1 引言 1

1.2 组织工程支架材料 2

1.2.1 生物降解型 2

1.2.2 非生物降解型 2

1.3 透明质酸多孔复合支架的制备与研究 3

1.3.1 透明质酸简述 3

1.3.2 透明质酸与其他材料复合 3

1.4 研究目的及主要研究内容 4

1.4.1 目的及意义 4

1.4.2 主要研究内容 5

第2章 明胶微球的制备 6

2.1 引言 6

2.2 实验原料和仪器 7

2.1.1 主要原料与试剂 7

2.1.2 主要仪器 7

2.3 实验原理和实验方法 7

2.3.1 实验原理 7

2.3.2 实验方法 7

2.4 材料测试与表征 8

2.4.1傅里叶红外光谱分析（FT-IR） 8

2.4.2 SEM形貌分析 8

2.5 实验结果与分析 8

2.5.1 傅里叶红外光谱分析 8

2.5.2 SEM形貌分析 9

2.6 本章小结 10

第3章 透明质酸/明胶微球复合支架的制备及其性能研究 12

3.1 引言 12

3.2 实验原料和仪器 13

3.2.1 主要原料与试剂 13

3.1.2 主要仪器 13

3.3 实验原理和实验方法 13

3.3.1 实验原理 13

3.3.2 实验方法 14

3.4 材料测试与表征 14

3.4.1 性能测试 14

3.4.2 傅里叶红外光谱分析（FT-IR） 15

3.4.3 SEM形貌分析 15

3.5 实验结果与分析 15

3.5.1探究透明质酸/明胶微球复合支架制备的最佳配比 15

3.5.2探究透明质酸/明胶微球复合支架制备的最佳微球粒径 17

3.5.3支架微观结构分析 18

3.6 本章小结 19

第4章 结论与展望 20

4.1 主要结论 20

4.2 展望 20

第1章 绪论

引言

近年来，随着人体衰老和受伤发生率的增加，肌肉骨骼疾病频发，影响着大家的生命健康^[1]。当人体组织受伤时，会影响机体器官的正常功能，以往选用的医治方式是自体组织移植术，虽然医治效果显著，但不仅会对自身健康组织带来伤害，还会带来许多并发症及其他损伤；若采用器官移植的方法进行治疗，容易产生免疫排斥反应，且供体器官不易获得、获取代价大。Langer提出了“组织工程”的概念,同传统方法相比,组织工程技术治疗修复骨骼肌肉疾病更为有效，可以解决许多器官功能受损、组织损伤的问题^[2-3]。

组织工程，是一门旨在研究生物医学材料以修复、提高、替代人体组织或器官的学科。组织工程的三大要素是种子细胞、可降解的支架材料、细胞生长调节因子。种子细胞是用于培养新生组织和器官的各种细胞；细胞生长调节因子是用于指导组织内细胞活动的各种方式；支架是用于支撑细胞生长为一个完整组织的材料。应用于组织工程的支架材料是组织工程的基础,决定组织工程成功与否,因此,找寻一种具有形状固定、具有多孔连通结构，且生物降解性、生物相容性、机械性能优异的支架材料至关重要。

理想组织工程支架材料应有如下特性:(1)生物相容性:支架应用于人体组织不会带来并发症与免疫排斥反应；(2)生物降解性:支架在发挥完其作用，新组织生成后可被体内降解；(3)生物活性:支架材料可与细胞结合并发挥作用，刺激细胞附着和分化，促进新生组织的形成；(4)支架架构:支架应有相互连通的孔状结构,允许细胞扩散和迁移,促进细胞向内生长而不削弱机械强度；(5)机械性能:支架应与正常组织机械强度相当,允许细胞正常活动并保持体内结构的完整性^[4-5]。

组织工程支架材料

组织工程支架材料是指能移入机体内并与细胞结合，可发挥被替代组织功能的材料。由生物材料构建的与细胞外基质成分相似的细胞支架可以使种子细胞增殖和分化。组织工程支架材料包括：骨组织、血管组织、神经组织、皮肤组织及其它组织工程支架材料。常用的骨组织工程支架材料分为两种，即生物降解和非生物降解型。

1.2.1 生物降解型

生物降解型材料生物活性好、生物相容性卓越，容易降解，但机械性能不好，组成的成分分布不均。这类材料有胶原蛋白、壳聚糖、海藻酸盐、透明质酸、聚乳酸等。

胶原蛋白是从动物结缔组织中获取，属天然生物高分子材料，占人体蛋白总量的 25.33%，是人体中含量最丰富、分布最广的功能性蛋白质^[6-8]。可通过水法、酸法、碱法、酶法、盐法从陆生哺乳动物和海洋生物体内提取胶原蛋白，胶原蛋白种类非常多，常见类型为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型^[9]。胶原蛋白因其良好的生物活性、生物相容性和生物降解性被广泛应用。Hirukawa M等以胶原蛋白为主要成分合成人工韧带，应用到韧带重建手术中，解决了供体来源受限、容易产生排斥污染的问题^[10]。张其清等发明公开了一种负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料,制备出对机体无害、生物相容性好及具组织修复能力的支架材料，且有效的解决了BMP体内半衰期较短、生长因子定向诱导局部缺损修复等问题，延长了其功能的充分发挥^[11]。

聚乳酸是一种新型的生物降解材料，属于合成的生物降解材料。通常的制备方法是从植物中提取淀粉，淀粉经发酵可变为乳酸，再经聚合反应合成聚乳酸。与天然材料相比，合成生物可降解材料细胞相容性差，但质地均一，具有简单清晰的结构与特性，不易与机体发生免疫排斥反应，机械性能优异，是一种可靠的组织工程支架材料的来源，通过表面修饰、化学改性等方式可改善细胞粘附力差的缺陷。林成楷等利用聚左旋乳酸与多壁碳纳米管制备支架材料，既可增加细胞粘附性，又可利于神经细胞的增殖分化，在修复脊髓损伤方面具有巨大潜能^[12]。由于细菌纤维素强度、结晶度、机械强度高，生物相容性优良，王云风利于其与聚乳酸复合，制备的新型支架：聚乳酸/细菌纤维素复合支架断裂强度增强，经过细胞毒性、粘附、增殖实验评价，可应用于组织工程^[13]。

1.2.2 非生物降解型

非生物降解型的组织工程支架材料机械强度高、具有生物惰性等优点。这类材料有：金属材料、高聚物、生物惰性陶瓷、生物活性陶瓷等。

磷酸三钙(TCP)又称磷酸钙，具有不同的晶型转变,主要为高温α相(α-TCP)和低温β相(β-TCP),由于α-TCP会快速降解,因此在医学上使用较多的主要是β-TCP。β-磷酸三钙的主要成分是钙和磷,与骨基质的无机成分相似,容易与骨结合,具有引导软骨组织生长的能力，活体细胞可以在β-磷酸三钙材料上正常生长、增殖、分化。β-磷酸三钙生物相容性好，但单独用作支架材料时亲水性差，导致细胞粘附性差,容易发生免疫排斥反应。为了满足骨修复支架材料的要求,需要对β-磷酸三钙进行改性以完善其性能缺陷。薛媛等将纳米β-磷酸三钙、胶原及磷酸软骨素进行交联制备了纳米β-磷酸三钙-胶原/硫酸软骨素支架复合材料,所得支架相互作用强,稳定性好,是一种潜能巨大的口腔修复材料^[14]。张宁等选择将β-磷酸三钙加入到聚乳酸中,制作出200~400 μm孔径的新型聚乳酸/β-磷酸三钙(PLLA/β-TCP)复合多孔支架材料,既改进了β-磷酸三钙脆性大的缺陷,又解决了聚乳酸降解产物偏酸性,在体内易引起无菌性炎症的问题,制作出一种潜力巨大的组织工程骨支架材料^[15]。

透明质酸多孔复合支架的制备与研究

1.3.1 透明质酸简述

透明质酸(hyaluronic acid，HA)是软结缔组织细胞外基质的主要成分之一，是一种酸性黏多糖，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖双糖重复单位交替多次连接而组成的，结构如图1-1所示^[16]。1934年哥伦比亚大学教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中提取分离出透明质酸^[17]，如今制备透明质酸的方式一般有三种：从动物组织中提取（主要是从鸡冠和牛眼玻璃体等中提取）、微生物发酵（以葡萄糖作为碳源发酵液）及化学合成（采用天然酶聚合反应）。由于从动物组织中提取分离透明质酸过程繁琐，且产率极低，而化学合成产物结构较不精纯，现在可靠的制备透明质酸的方式是微生物发酵，成本低、产率高、工序简单且易大规模生产。

透明质酸保水性好，是自然界中最好的保湿性物质，被称为理想的天然保湿因子，由于其良好的水溶性和保湿型，透明质酸被应用到化妆品中，起保湿补水的作用，使皮肤嫩滑。透明质酸又因其良好的生物相容性、生物降解性，可用作生物医药材料如仿生支架材料。透明质酸也可与细胞发生相互作用，促进细胞的迁移、增殖、分化，促进组织修复。此外，透明质酸在减肥、抵御癌症、促进生长发育、免疫炎症等方面也发挥着重要的作用。

图1-1 透明质酸结构式

1.3.2 透明质酸与其他材料复合

透明质酸虽然保湿性、生物相容性好，被广泛应用于化妆品及医学领域，但其对强酸、强碱、热、自由基以及透明质酸酶敏感，稳定性差，在一些方面的应用受到牵制，可对透明质酸进行改性，改善它的缺陷，以让其可应用于更多领域。对透明质酸的改性方法如图1-2所示，既可利用透明质酸所含的羟基、羧基等对其进行化学改性，也可将透明质酸与其他材料进行共混改性，由于透明质酸水溶液可以电离出-COO^-，通过静电作用可实现复合改性，可根据不同的应用领域选用不同的改性方式，以获取满足需求的透明质酸^[18]。