文 献 综 述

1. 引言

ROS是一组具有氧化还原活性的自由基和分子氧衍生物的总称，是有氧呼吸及其他分解和合成代谢过程中产生的副产品并在各种生理过程中起着重要的作用，包括超氧阴离子(O₂#8226;^-)，羟基自由基(#8226;OH),过氧自由基(ROO#8226;),烷氧自由基(RO#8226;),过氧化氢(H₂O₂),单线态氧(#8226;O₂)和次氯酸(HOCl)等^[1]。线粒体、内质网、溶酶体等多种细胞结构都可以产生并释放ROS。如图1所示，细胞内源性ROS是由超氧阴离子(O₂#8226;^-)衍生而来^[2]。

图1 细胞中ROS的产生

次氯酸(HOCl)是生物活性氧(ROS)之一，在生理条件下(pKa = 7.46)可部分分解为次氯酸根阴离子 (OCl-),是生物体内一种有效的免疫系统氧化剂和抗菌剂^[4]。生物体内HOCl是由H₂O₂和Cl^-离子在白细胞中MPO的催化作用下产生。MPO又称过氧化物酶，是一种血红素蛋白，在调节炎症方面发生作用^[5]。由于HOCl的强氧化作用,低浓度HOCl可以通过与各种生物分子(包括DNA,RNA和蛋白质等)反应来破坏侵入性细菌和病原体^[6]。不幸的是,吞噬细胞HOCl产生的失衡却可能会破坏细胞膜上的蛋白质,导致细胞裂解和组织损伤,并可能加剧各种人类疾病,包括阿尔茨海默病,心血管疾病,神经元变性[,肺部病变,甚至癌症^[7-9]。此外，HOCl作为一种高效、快速的微生物杀菌剂，在临床应用已有100多年的历史。HOCl也被广泛应用于食品加工和水供应的处理，与人们的食物链密切相关^[10]。因此,开发快速有效的HOCl检测方法具有重要意义,这将有助于我们研究HOCl的生物学功能和相关疾病的发病机制。

2、HOCl的传统检测方法

目前，已经有大量的文献报道了关于HOCl的检测方法，包括化学发光(CL)检测、电化学、色谱分析、流动注射分析等。CL是化学反应引起的发射现象。由于HOCl具有较高的氧化性，可作为氧化剂，与CL试剂反应，通过测量发光强度来计算出HOCl的浓度^[11]。次氯酸盐的电化学方法于1997年被提出，它能够以较低的设备成本快速地检测分析物，并有可能对目标物种进行实时连续监测^[12]。色谱方法，包括HPLC和IC，已被用于测定散装溶液中的HOCl^[13-14]。但是，这些方法一般都具有灵敏度低、检出限高、选择性差、技术成本高以及难以实现HOCl在细胞内的直接成像等缺点。所以开发HOCl的高效快速检测及直接成像技术是非常重要的。

3、荧光探针分析法

荧光(fluorescence)是一种光致发光的冷发光现象^[15]。一些特殊物质经由紫外或可见光照射时，会吸收某波长的光继而发射出不同颜色和强度的可见光，当停止照射时，物质发射出的光也随即消失，这种光被称为荧光。1575年，西班牙植物学家N.Monardes发现在太阳光的照射下，一种木头切片的水溶液呈现出天蓝色，这是历史上对荧光现象的最早的记载。到了1852年，英国数学家及力学家 G. G. Stockes 发现这原来是一种光发射现象，提出了 ”Fluorescence”(荧光)的概念，并且解释了产生该现象的原因^[16]。从此之后，荧光的产生机制才慢慢被人了解清楚。

具有荧光性质的分子受到光激发吸收入射光的能量，基态电子会跃迁到激发态，而处于激发态的电子不稳定，通过振动驰豫、内转移等无辐射跃迁的方式衰变回基态，这一过程会伴随荧光的发射。值得注意的一点是，物质发射的荧光颜色与入射光颜色无关，只与受到入射光激发的原子或分子本身的震动能级相关^[15]。

荧光探针通常是由识别基团和荧光基团两部分组成，可以特异性的与带测物质发生作用，而产生相应的荧光信号^[17]。并且可以借助荧光分光光度计、激光共聚焦显微镜等仪器测量待检物的浓度、观察待测物在细胞组织中的分布情况。荧光探针中的识别基团能够特异性的结合待检测物质，从而改变探针分子所处的化学环境。而荧光基团则可以将识别的信息转换成荧光信号，通常是由能够吸收特定波长并释放出荧光的物质充当。较为经典的荧光基团如图2所示，分别是香豆素^[18]、氟硼二吡咯(BODIPY)^[19]、萘酰亚胺^[20]、荧光素^[21]、花菁类(Cys)^[22]、罗丹明^[23]等。

图2 经典荧光基团母体结构

荧光探针分析法通常具有较大的有斯托克斯位移，即在激发光的波长要小于荧光光谱中得到的荧光波长，有利于降低背景干扰，提高检测的灵敏度；其次、荧光探针分析方法还具有选择性好，方法简捷，取样量少，技术成本相对较低，且重现性好等优点。正因为荧光分子探针分析法具有以上这些优点，所以近几年越来越多的化学科研工作者投身到荧光探针的设计和应用的研究中。

4. HOCl荧光探针

目前为止，已出现大量的基于有机分子的HOCl探针的报道，用于设计合成HOCl探针的母体主要有香豆素类化合物，氟硼二吡咯类化合物、萘酰亚胺类化合物、荧光素类化合物、花菁类化合物、罗丹明类化合物等。下文中选取几种探针介绍有机荧光探针检测次氯酸的研究进展。

（1） 以香豆素为母体的HOCl荧光探针探针

香豆素类荧光基团具有Stockes位移大，量子产率高，光稳定性好以及光物理、光化学性质可调等优点，近几年成为有机荧光探针研究的重点之一。但是因为香豆素类化合物水溶性较差，一般需要有机溶剂助溶。

图3 以香豆素为母体合成的荧光探针探针1识别HOCl

如图3所示，在2014年，Yue Y等^[24]开发了一例以香豆素和半花菁染料为骨架的比率型荧光探针用于HOCl检测。在HOCl存在环境下，探针1分子中共轭的C=C双键发生氧化断裂，480 nm和631 nm出的荧光强度比率提高了400倍，溶液颜色发生由紫色到无色的明显变化，实现了HOCl的裸眼识别。此外，荧光探针探针1对HOCl表现出高的选择性，对其他ROS和RNS均不发生反应。

图4 一种基于香豆素的新型开关荧光探针COMS

如图4所示，在2018年，Liu和Li等^[25]研制了一种基于香豆素的开关型荧光探针CMOS，用于检测次氯酸(HOCl)氧化应激和半胱氨酸/同型半胱氨酸(Cys/Hcy)还原过程。该探针响应快，灵敏度高，选择性好。此外，COMS还被应用于活体细胞氧化还原过程的监测，取得了良好的效果。CMOS有望成为研究生物和医学研究中氧化损伤和生物硫醇修复的潜在工具。

（2） 以氟硼二吡咯为母体的HOCl荧光探针

氟硼二吡咯类荧光基团有尖锐的荧光发射峰和紫外吸收峰，其摩尔消光系数比较大并且对pH的耐受性好，在生理环境中较稳定，因而氟硼二吡咯类荧光基团在近几年收到了广泛的研究。

图5 一种基于氟硼二吡咯的荧光探针MitoClO

如图5所示，在2103年，Cheng等^[26]开发了一例以氟硼二吡咯荧光基团为母体的荧光探针。该荧光探针由于C=N双键的淬灭作用基仅仅有微弱的荧光，在荧光探针分子与HOCl发生作用之后，醛肟反应变成羧基，在527nm处出现了强的荧光响应信号，并且随着HOCl加入量的增加，一定浓度范围内，527nm处荧光响应信号线性增加，实现了HOCl的定量检测。在细胞成像测试中发现，该荧光探针定位于细胞的线粒体中。

图6 一种基于氟硼二吡咯的荧光探针Probe 1

如图6所示，在2018年,Li和Tang等^[27]设计了一例由氟硼二吡咯和2,4二硝基苯肼组成的荧光探针用于检测HClO。荧光探针和HClO之间的氧化反应导致了明显的荧光增强，并且反应体系由粉红色变为。该荧光探针与除HOCl之外的常见的活性氧物质并不发生反应，具有优异的选择性，灵敏度高，检测限为228 nM。观察到快速响应(7分钟)，这使该荧光探针成为实时检测的有前景的方法。此外，该荧光探针成功应用于监测真实水和活细胞中的HClO。凭借这些吸引人的特性，该探针进一步用于细胞内HOCl的成像研究。但是仍然需要有机溶剂助溶。

(3)以萘酰亚胺为母体的HOCl荧光探针

萘酰亚胺的优点在于吸收波长长，稳定性好和斯托克斯位移大。基于以上优点，萘酰亚胺荧光成为从事荧光探针方向研究的科研工作者构筑新型探针时首要考虑的荧光基团之一。

图7 一种以萘酰亚胺为母体构筑的HOCl荧光探针

如图7所示，在2017年，Zhang等^[28]成功地研制了一种基于分子内电荷转移(ICT)的双光荧光探针，用于次氯酸检测。该荧光探针对HOCl的选择性优于其它ROS、RNS和金属离子，这可能与硫醚的选择性氧化有关。该荧光探针具有良好的选择性、灵敏度并且对HOCl可以裸眼识别，具有很好的应用前景。生物成像应用实验表明，该荧光探针能准确地跟踪活细胞内溶酶体的HOCl水平。

(4)以荧光素为母体的HOCl荧光探针

荧光素性能优良，具有水溶性。但是荧光素对pH敏感，只能在较窄的pH范围内进行检测。

图8 一种基于荧光素的HOCl荧光探针

如图8所示，在2012年,姚成课题组^[29]以氢化荧光素为平台开发了一例性能优良的荧光探针，并成功的用以检测水相和斑马鱼器官中HOCl的生物学分布情况。荧光探针在HOCl的作用下荧光探针及分子结构中的苯酚结构被氧化成苯醌，从而释放出强烈的荧光信号，实现了HOCl的检测。

图9 一种基于荧光素的HOCl荧光探针

如图9所示，2015年，Wang等^[30]开发了一例基于荧光素的荧光探针，可以灵敏的、专一的检测HOCl。由于偶氮的强”吸电子”性，荧光探针分子本身仅仅有微弱的荧光。加入微量的HOCl，肼基氧化断裂生成醛基，荧光探针释放出强烈的荧光信号。该探针表现出优异的水溶性和生物相容性，成功的应用于细胞内源性HOCl的检测。

(5)以花菁类为母体的HOCl荧光探针

花菁类染料具有最大吸收波长可从可见区调谐到近红外区以及摩尔吸光系数大等优点。花菁类染料一般具有两个N原子，与奇数碳原子的共轭连相连的N原子带有正电荷，共轭链的另一端与另一个N电子相连使花菁类染料具有明显的”推-拉”电子结构。但是由于花菁类染料的光稳定性较差，测试结果精准度不够。

图10 一种以花菁为母体的HOCl荧光探针

如图10所示，在2016年，Tian等^[31]以花菁染料为母体结构开发了一种近红外荧光探针。荧光探针含S部分是与HOCl特异性反应的位点，随着HOCl的加入，荧光探针结构发生变化，光诱导电子转移过程也被改变，随意释放出强烈的荧光信号。通过检测MPO-H₂O₂-Cl^-系统产生的HOCl，可以定量的测定MPO的活性，这在临床上具有重要的意义。

图11 一种以花菁为母体的HOCl荧光探针

如图11所示，在2014年，彭孝军课题组^[32]以花菁为母体，通过引入硒吗啉基团构筑了一例对HOCl敏感的近红外荧光探针，并且实现了纯水相和小鼠体内内源性HOCl的检测。该荧光探针灵敏度高，对于除HOCl之外的ROS不发生任何反应，检测限为0.32μM，并且能够实现HOCl的快速检测，为荧光探针在生物体环境下的应用奠定了良好基础。

5.以罗丹明为母体的HOCl荧光探针

罗丹明及其衍生物是呫吨类碱性染料，基本骨架为氧杂蒽，由于氧杂蒽中氧桥的存在，整个罗丹明分子具有稳定的刚性共平面结构，在激发光作用下可以发射出强烈的荧光信号，最大发射波长在500nm-700nm红色可见光区内^[33]。罗丹明基团具有以下优点：1)荧光量子产率高。荧光量子产率关乎检测的灵敏度，荧光量子产率越高意味着检测的灵敏度越高；2)吸收与和发射波长较长，有利于避免生物体内小分子产生的背景干扰；3)斯托克斯位移较大，这将提高检测的准确性；4)溶解性和稳定性好，扩展了荧光探针的应用范围；5)细胞膜穿透性好并且细胞毒性低，便于荧光探针进入生物体或细胞内进行荧光成像。基于以上种种优点，以罗丹明为母体的荧光探针受到广泛的研究，被用于金属离子和各种小分子的检测中，包括扩ROS和RNS的分析以及更加复杂的生物体系的研究等。

图12 一种以罗丹明B为母体的HOCl荧光探针

如图12所示，在2010年，Zheng等^[34]以罗丹明B为母体基于HOCl诱导硫代内酯氯化水解反应合成了一例荧光探针，并且成功的用以水相HOCl检测和人体血液中白细胞内HOCl的荧光成像，对于研究HOCl的生物行为有重大意义。荧光探针分子与HOCl作用，使得硫代内酯打开，释放出强烈的荧光信号，经实验确认水解之后的最终产物是罗丹明B。该荧光探针选择性优良，检测快速有效，检测线低，检测的线性区间为0.5-7μM。

图13 一种以罗丹明B为母体的HOCl荧光探针

如图12所示，在2011年，Liu等^[35]设计，合成和表征了一例用于HOCl和Cu² 检测的新的基于罗丹明B的双功能染色和荧光探针。该探针包含罗丹明B的光谱单元和吡啶甲酰胺的Cu² 特异性螯合单元以及二酰基肼的HOCl特异性反应性部分，是一种高选择性且极其灵敏的荧光和比色传感器，用于不同pH条件的Cu² 和ClO^-检测。与报道的Cu² 或ClO^-探针相比，这是第一个基于能够同时检测Cu2 和ClO^-小分子的化学传感器。

图14 一种以罗丹明B为母体的HOCl荧光探针

如图14所示，在2014年，Zhang和Chen等^[36]开发了两种比率荧光探针用于检测HOCl。 探针1显示在碱性条件下对HOCl响应极好。 探针1与HOCl反应产生香豆素 - 霍达明酸(探针2)，导致荧光变化。 此外，论文作者提出了一种新的策略，用于基于氯化诱导的罗丹明 - 香豆素二聚体(探针2)的环化和FRET荧光转换机制来检测HOCl。 探针2具有高灵敏度和选择性，实时检测和在生理条件下的膜渗透性能力显着。 探针2可在用于评估HOCl在生物系统过程中将发挥关键作用。

图15 一种以罗丹明为母体的HOCl荧光探针

如图15所示，在2017年，Li和Hou等^[37]开发了一例生物素 - 罗丹明-TPP结合物(BiTClO)的实时(10秒内)荧光探针，用于检测线粒体次氯酸。该探针具有良好的选择性和高灵敏度(0.21 lM)。 此外，它是第一个应用于细胞成像的肿瘤特异性和线粒体成像荧光探针。

图16 以罗丹明为母体的HOCl和NO荧光探针

如图16所示，在2018年，Ong等^[38]开发了一个由香豆素供体和罗丹明受体构建新的预组装比率传感平台。安装苯乙炔接头以破坏延伸的共轭体系的平面性，但保留供体和受体基序之间的有效能量转移。为了证明其作为传感平台的多功能性，作者通过引入不同的识别基团，设计合成两个能够检测内源产生的NO和ClO的荧光探针。 两种探针对其分析物具有高选择性，在生理条件下表现出良好的稳定性，并且在活细胞中作为生物成像探针表现良好。

由于上述论述可以得知，因为荧光探针具备信号可视化,选择性高,技术成本相对较低的优点，所以荧光技术成为现代生物分析和实时生物成像最重要的工具，并且得到了广泛的研究。

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荧光探针在检测过程中通常存在量子产率低,灵敏度低,生物相容性差和光漂白等问题。并且,这种检测方法通常容易受到复杂生物环境的自发荧光背景的干扰。幸运的是,镧系元素掺杂的上转换纳米颗粒(UCNPs)避免了这些限制。稀土掺杂的上转换纳米颗粒(UCNPs)可以将可见激发转化为近红外激发,这归功于上转换纳米颗粒中的镧系元素掺杂物的阶梯状能级依次吸收两个或更多低能光子。UCNPs具有数百纳米的大的反斯托克斯位移,没有光漂白,更大的穿透深度,并且没有生物标本的自发荧光,这使其在生物成像与医疗诊断领域有重要应用。因此,越来越多的研究团队致力于开发用于小分子检测和生物成像的新型UCNPs探针。本论文拟开发了一种新的基于发光共振能量转移(LRET)的水溶性介孔二氧化硅涂层UCNPs纳米探针,用于水溶液中HOCl的比率上转换发光(UCL)检测以及细胞内源性HOCl上转换发光(UCL)成像研究。

第一步，在罗丹明6G结构上进行修饰，设计合成一例合成步骤简单、选择性优异、检测灵敏度高并且抗干扰能力强的HOCl荧光探针。

通过广泛的文献阅读，我们发现异羟肟酸的HOCl介导的氧化反应遵循氯化路径，以在消除HCl之后得到酰基亚硝基化合物。该不可逆转的反应可以结合到罗丹明酰胺体系中，构建一个对HOCl具有高选择性的有机荧光探针。

第二步，合成稀土掺杂的纳米晶。通过调节UCNPs内掺杂的的Er³ 和Tm³ 的比例,以调节三种不同通道(²H_11/2→⁴H_15/2(514-534 nm); ⁴H_3/2→⁴H_15/2(534-560 nm)和³H₄→³H₆(780-830 nm)),这可以保证在HOCl的作用下产生比例UCL信号。

第三步，罗丹明衍生物修饰稀土纳米晶上转换HOCl探针的合成并完成表征工作。如下图所示，本论文设计的纳米传感器的核心由UCNPs组成，核被中孔SiO₂层包围,罗丹明6G衍生分子R6GH包含在孔中。壳的表面用环糊精(CD)表面配体进一步修饰以增强纳米荧光探针在生理环境中的水溶性和稳定性。

第四步，在罗丹明衍生物修饰稀土纳米晶上转换HOCl探针合成工作完成之后，利用该纳米探针分别于HOCl进行紫外、荧光滴定分析，相关离子、分子干扰性测试。细胞内源性HOCl上转换发光(UCL)成像实验。最后将该上转换纳米探针应用到生物体内，即在在MPO酶促体系中用上转换纳米探针预孵育细胞,利用上转换发光显微镜对活细胞内源性HOCl的分布进行可视化成像研究，并进行上转换纳米探针的细胞毒性测试。