摘 要

心血管疾病和外周动静脉疾病严重威胁人类健康，目前临床对于严重的患者多采用血管移植手术治疗，在自体血管来源不足的情况下人们开始探索人造血管。人工血管除满足血管的基本功能之外，还要满足强度、韧性、组织血液相容性、无毒、抗感染、抗血栓形成等特点。目前临床多使用的涤纶、四氟乙烯等织造性人工血管是不可降解生物材料，无法满足患者生长发育的需求，因此近年来大量生物可降解材料以其良好的体内可降解性，生物相容性好、毒性低、不易形成血栓受到广泛关注。在本课题中通过实验新合成材料PEG-co-PXS，并使用MTT、CCK-8、Alamar Blue三种试剂方法对PEG、TPU、PLLA、PEG-co-PXS四种可降解材料细胞毒性进行实验测试，最终经数据分析对比得到几种材料的细胞毒性比较，PDLLA毒性最小，PEG含量为80%的PEG-co-PXS和PEG的毒性都较小，有制备人工血管材料的可能性，为日后研究用于制作人工心血管材料的可降解生物材料研究提供部分依据。

关键词：心血管疾病；可降解生物材料；人工血管；细胞毒性

Abstract

Cardiovascular diseases and peripheral arteriovenous diseases are a serious threat to human health. Currently, serious vascular transplantations are often used for treating severe patients. In the absence of autologous blood vessels, people began to explore artificial blood vessels. In addition to the basic functions of the blood vessel, the artificial blood vessel also needs to meet the characteristics of strength, toughness, tissue blood compatibility, non-toxicity, anti-infection, and anti-thrombosis. At present, clinically used woven artificial blood vessels such as polyester and tetrafluoroethylene are non-degradable biomaterials and cannot meet the needs of patients' growth and development. Therefore, in recent years, a large number of biodegradable materials are known for their excellent in vivo degradability and biocompatibility, low toxicity, and less likely to form thrombi have received widespread attention. In this topic, firstly, a new synthetic material PEG-co-PXS was synthesized, and MTT, CCK-8, and Alamar Blue reagents were used for the four degradable material cells: PEG, TPU, PLLA, and PEG-co-PXS. Toxicity was tested experimentally. Finally, cytotoxicity of several materials was compared by data analysis and comparison. The toxicity of PDLLA was minimal. The toxicity of PEG-co-PXS and PEG with a PEG content of 80% was small, and there was a possibility of preparing artificial blood vessel materials. This will provide some basis for future studies on the research of biodegradable biomaterials used to make artificial cardiovascular materials.

Keywords: cardiovascular disease；biodegradable biomaterial；artificial blood vessel；cytotoxicity

目录

第一章 绪论 1

1.1论文研究的目的及意义 1

1.1.1生物可降解材料在心血管疾病治疗上的应用 1

1.1.2本课题所研究生物可降解材料的特性及应用 2

1.1.3本课题所选用细胞的特点和优势 2

1.2国内外文献的研究进展 3

1.2.1聚乳酸（PDLLA） 3

1.2.2聚氨酯（TPU） 3

1.2.3聚乙二醇（PEG） 4

1.3研究内容、研究目的与技术路线 4

1.3.1研究内容 4

1.3.2研究目的 4

1.3.3技术路线 4

第二章 实验所用的试剂仪器介绍及其原理和方法 6

2.1试剂以及仪器 6

2.1.1 药品试剂及其生产公司 6

2.1.2 仪器以及生产公司 6

2.2 生物材料的合成 7

2.2.1 试剂及仪器的准备工作 8

2.2.2预聚物的合成 8

2.2.3预聚物的酰基化 8

2.2.4酰基化产物的透析提纯 9

2.2.5 终产物的光聚合 9

2.3生物材料细胞毒性的评价 10

2.3.1 MTT法测定细胞毒性 10

2.3.2 CCK-8法测定细胞毒性 10

2.3.3 Alamar Blue法测定细胞毒性 10

第三章 几种材料的细胞毒性检测 11

3.1 48孔板中最适细胞接种浓度的测定 11

3.1.1实验原理 11

3.1.2 实验方法 11

3.2 标准曲线的测定 11

3.2.1稀释细胞浓度使之成梯度： 11

3.2.2配置实验所需试剂 12

3.2.3测试OD值 12

3.3 材料毒性检测 12

3.3.1使用材料 12

3.3.2材料预处理 12

3.3.3实验步骤 13

第四章 数据分析及结果讨论 14

4.1 48孔板最适细胞接种浓度测定结果 14

4.2 三种试剂的标准曲线结果 14

4.2.3 MTT标准曲线结果 14

4.2.1 CCK-8法标准曲线结果 15

4.2.2 Alamar Blue法标准曲线结果 16

4.3 材料毒性测定结果 16

第五章 结语 20

5.1结果讨论 20

5.2存在的问题及进一步展望 20

参考文献 21

致谢 23

第一章 绪论

1.1论文研究的目的及意义

心血管疾病是一种严重威胁人类健康的常见病，对于患有心血管疾病的患者，通常使用血管移植手术进行治疗，但自体血管来源十分有限，同种异体血管的长远效果又不甚理想，部分患者会出现血管变性、异常增生、血管再狭窄等情况。因此，人们开始探索人工血管的合成。理想的人工血管要在满足天然血管的基本功能之外，还要有一定的强度和韧性，应具备血液相容性良好、无毒，抗感染，抗血栓形成等特点。现阶段临床多采用涤纶、四氟乙烯等人造材料，但其血液相容性及抗凝血性能较差，无法满足人体长期利用的需求，寻找新的血管材料显的尤为重要。随着医疗手段、生物工程技术、基因技术手段等的不断发展，生物材料因其生物相容性、可降解性等方面则表现出其独特的优势，利用生物材料合成人工血管成为必定的趋势,探索适合用于制作人工血管的材料并将其用于人工心血管的研究，将有效缓解心血管疾病问题。

1.1.1生物可降解材料在心血管疾病治疗上的应用

从上世纪到现在，多种不同单体所合成的生物材料被研发应用于医学领域，在心血管疾病的治疗方面，也发挥了极其重要的作用，主要有以下几方面：

1.生物可降解心血管支架。当前每年全世界需要进行经皮腔内冠状动脉血管成形术的患者超过200万，其中70%的冠心病患者需要置入血管支架，但传统金属支架的应用容易引发一系列并发症，如血栓的形成和再狭窄的发生等情况。但生物可降解支架可有效缓解此类问题。与传统金属支架相比较，生物可降解支架不光具有金属支架具有的良好的机械性能，并且可在3-6月之内被完全降解，且其降解产物完全无毒，无副作用，可减少炎症发生的可能性^[1]。除此之外，生物可降解支架还有利于细胞的粘附、增殖和分化，并具有良好的生物相容性。在临床应用中更可行，更安全。生物可降解支架主要包括药物涂层支架、生物可降解膜被覆支架、载药生物可降解性冠状动脉支架和完全生物可降解性冠状动脉支架四种 ^[2-5]。其中，主要应用于临床的是药物涂层支架，此种支架可有效减轻炎症反应、延长支架内再狭窄的时间且易定位^[6]。

2．人工血管。人工血管是利用组织工程学、生物技术等方法，在生物相容性良好的支架材料上“种植”血管内皮细胞、平滑肌细胞等血管种子细胞，以构建形态功能等都和天然血管类似的组织工程化血管的方法。使用人工合成血管来替代自体血管可有效解决心血管临床治疗中自体血管资源不足的情况^[7]。具体研究内容将在本文1.2中进行陈述。

1.1.2本课题所研究生物可降解材料的特性及应用

1.1.2.1聚消旋乳酸（PDLLA）

聚乳酸是一类可完全降解，对环境友好的生物可降解高分子材料，以乳酸为主要原料聚合得到，它的生物相容性及可降解性良好，可在酶、微生物、酸、碱等因素的作用下被完全分解为CO2和H2O。同时，其机械性能及物理性能良好^[8]。聚乳酸共有三种异构体：PDLA、PLLA、PDLLA.本实验中使用PDLLA，其具有非结晶性^[9]。PDLLA毒性极小，已获得FDA认证。其在生物医疗和组织工程领域应用广泛，组织工程材料、骨科内固定材料、免拆型手术缝合线、药物缓释包装剂等^[10]。

1.1.2.2聚乙二醇（PEG）

聚乙二醇是一种毒性小、水溶性好、生物相容性高的高分子聚合物，因其末端羟基活性基团很容易发生化学反应，从而在生物工程上多被用来进行各种化学改性。在化工、制药、生物工程等行业中均有着极为广泛的应用。其在生物医学领域的应用主要有：合成润滑药、药物缓释和固定化酶的载体、医用高分子材料表面改性等。

1.1.2.3热塑性聚氨酯（TPU）

热塑性聚氨酯是一种嵌段共聚物，其由两种化学性质不相似的链段组成，是一种热塑性弹性体。具有良好的耐磨损性、耐水解性，此外，其组织相容性、血液相容性良好，因而在生物医学领域被广泛应用，已经有心脏起搏器、导管、柔韧的血管移植体、辅助心脏瓣膜等。

1.1.2.4聚乙二醇多聚癸二酸木糖醇（PEG质量分数为80%的PEG-co-PXS）

PEG-co-PXS作为一种全新合成的材料，其物理和化学性能资料几乎空白，通过对此种材料的实验合成及部分性能测试，癸二酸和木糖醇具有无毒，是人体代谢的正常内产物等优点，聚木糖醇癸二酸（PXS）是高弹性可降解生物材料但是预聚物不溶与水，PXS与PEG交联可增加其亲水性。此种材料作为一种新材料尚未投入应用，但根据其单体性能推断此种材料在制备心血管支架、制备心血管等组织工程方面具有研究潜力。（此种材料在后文中均简称为8PEXS-6M）

1.1.3本课题所选用细胞的特点和优势

在本实验中，主要选用小鼠胚胎成纤维细胞为材料细胞毒性测试的对象，其在细胞毒性实验方面有非常明显的特点和优势。小鼠胚胎成纤维细胞是小鼠胚胎时期的间充质细胞分化而来，细胞体型较大，轮廓清楚，多维凸起的纺锤形或星形的扁平状结构，细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。此种细胞的分离培养技术已相对成熟，目前对其生长规律有较为全面的认识，其形态明显，易于观察；另外，此细胞易于在体外生长，易成活且增殖较快。

1.2国内外文献的研究进展

关于生物可降解材料在心血管疾病治疗方面的应用以及本课题实验中所使用的PDLLA、PEG、TPU、8PEXS-6M四种材料的特性和应用已经在上文介绍，此部分着重就人工血管的研究现状以及本课题中所使用的的四种生物材料在制备人工血管方面的研究进展进行阐述。

经过几十年的发展，人工血管的研究因生物科学技术的高速发展而发生了巨大的转变，人工血管的研究从生物组织型阶段、合成型阶段到生物混合型再到目前的组织工程型阶段。发展方向始终是如何使得人工血管的物理性质、化学性质、生物性质无限接近人体血管在各方面表现的优异性能。目前在临床上，直径大于6cm的大口径人工血管已基本可以取代人体动脉血管，而小口径人工血管仍存在移植后长期效果不佳的问题，仍将成为今后人工血管领域研究的重点问题^[11]。

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