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摘 要

本论文以C. glutamicum NCF突变菌株为研究对象，通过重叠PCR扩增技术获得目的片段PgapA-accD1，用分子生物学技术构建重组质粒pK18mobsacB-Δldh-accD1，电转入C. glutamicum NCF突变菌株，构建重组菌株C. glutamicumNCF-1，根据基因整合以及用气相色谱的方法测定的脂肪酸合成量，期望进一步提高脂肪酸产量。在本次实验中，我们通过增加accD1基因拷贝数来提高脂肪酸合成途径代谢速率。当过表达accD1基因时游离脂肪酸产量为367.6 mg/L，比对照菌株提高了7.6%。C. glutamicum NCF和C. glutamicum NCF-1的生长情况类似，但与C. glutamicum NCF相比，C. glutamicum NCF-1的耗糖量较大。

关键词：谷氨酸棒状杆菌 游离脂肪酸 accD1基因 脂肪酸合成

Cloning and integration of accD1 from C. glutamicum

ABSTRACT

This paper is to investigate the transcript levels of key gene accD1 in fatty acid in the C. glutamicum mutants .Constructing the recombinant vector and Glutamic acid bacillus are contained in the experiment.According to the amount of gene expression and the determination of fatty acid composition by gas chromatography,, the pathway of free fatty acid metabolism of glutamic acid was modified by genetic engineering technology, and the production of fatty acid was expected to be further improved.In the C. glutamicum mutants, we improved fatty acid biosynthesis rate by increasing the accD1 gene copy number. When the accD1 genes was overexpression, it enabled a 7.6% higher free fatty acids concentration (367.6 mg/L) compared to that of contral strain.The growth of the two strain is similar,but sugar consumption of the one with the accD1 gene is larger.

Key words: Corynebacterium glutamicum；Free fatty ；accD1 ；fatty acid biosynthesis

目录

摘要 I

ABSTRACT II

目录 III

第一章 文献综述 1

1.1 脂肪酸的性质、分类、用途及应用前景 1

1.1.1脂肪酸的理化性质 1

1.1.2脂肪酸的分类 1

1.1.3脂肪酸的工业应用 1

1.1.4 脂肪酸的市场现状及前景 2

1.2脂肪酸的合成方法 2

1.2.1脂肪酸的化学合成法 2

1.2.2脂肪酸的生物转化合成法 3

1.3 微生物发酵法生产游离脂肪酸的研究进展 4

1.3.1 大肠杆菌基因工程改造研究 4

1.3.2 谷氨酸棒状杆菌基因工程改造研究 6

1.4乙酰辅酶A羧化酶解析 7

1.5 本实验的研究内容和研究的意义 8

1.5.1本实验研究的内容 8

1.5.2.研究的意义 8

第二章 材料与方法 9

2.1 实验材料 9

2.1.1 菌种和质粒 9

2.1.2 实验中所用的引物 9

2.1.3 实验所用的酶、分子量标准和试剂盒 10

2.1.4 实验试剂 10

2.1.5实验仪器 12

2.2 实验方法 13

2.2.1实验所用的培养基 13

2.2.2 发酵培养 13

2.2.3 感受态制备及转化 14

2.2.4 重组菌株C. glutamicum NCF-1的构建及验证 15

2.2.5分析方法 16

第三章 结果与讨论 18

3.1重组菌株C. glutamicum NCF-1的构建及验证 18

3.1.1重组质粒pK18mobsacB-Δldh-accD1的构建及验证 18

3.1.2重组菌株C.glutamicum NCF-1的构建及验证 19

3.2重组菌株C. glutamicum NCF-1发酵产游离脂肪酸研究 19

第四章 结论与展望 22

4.1 结论 22

4.2 展望 22

参考文献 23

致谢 27

第一章 文献综述

脂肪酸是一种重要的平台化合物，可进一步合成高能比生物燃料和诸如ω - 3多不饱和脂肪酸，聚羟基脂肪酸脂，脂肪醇等的高附加值油脂化学品,在食品、医药、化工等各领域都有广泛的应用前景。

1.1 脂肪酸的性质、分类、用途及应用前景

1.1.1脂肪酸的理化性质

脂肪酸（fatty acid），是指一端含有一个羧基的长的脂肪族碳氢链的有机物^[1]，脂肪酸是最简单的一种脂，它是许多更复杂的脂的组成成分^[1]。脂肪酸是由碳、氢、氧三种元素组成的一类化合物，是中性脂肪、磷脂和糖脂的主要成分^{[2, 3]}。

1.1.2脂肪酸的分类

根据性状不同可以分为二类，第一类是低级脂肪酸，无色液体并带有刺激性气味，第二类是高级脂肪酸，蜡状固体且无可明显嗅到的气味。

根据碳链脂肪酸代谢长度的不同可将其分为三类，第一类是短链脂肪酸（碳链上的碳原子数小于6），也称作挥发性脂肪酸；第二类是中链脂肪酸（碳链上碳原子数为6-12的脂肪酸），其主要成分是辛酸（C8）和癸酸（C10）；第三类是长链脂肪酸（碳链上碳原子数大于12），一般食物所含的大多是长链脂肪酸^{[1, 4]}。

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