论文总字数：23301字

摘 要

低聚木糖（Xylooligosaccharides, XOS）是益生元的一种，对肠道菌群有益菌－双歧杆菌（Bifidobacterium）的增殖效果明显，所以，增加双歧杆菌在人体肠道内的含量就显得尤为重要。本论文主要是通过构建松散蛋白-木聚糖酶融合蛋白（EXLX-XYN），并且经过吸附-催化耦合技术制备低聚木糖。添加松散蛋白（Expansin）的木聚糖酶紧密的吸附在底物玉米芯上，通过简单的清洗即可获得纯的融合蛋白。吸附-催化耦合反应一步制备高纯度低聚木糖。本论文主要成果如下：

（1）采用基因重叠延伸技术，融合了松散蛋白-木聚糖酶的基因，并在大肠杆菌实现异源表达。重组菌株破碎上清的木聚糖酶活力达156.8 U/mL，表观分子质量为40 kDa。优化连接肽的长度和柔性结果显示，刚性连接肽(EAAAK)₂的效果最佳，重组菌株破碎上清木聚糖酶活性达289.3 U/mL，是天然木聚糖酶表达产量的1.4倍；比酶活达52.7 U/mmol，是天然木聚糖酶XYN的1.3倍。

（2）吸附-催化耦合反应一步制备高纯度低聚木糖。在最佳条件吸附pH为7.0，吸附温度20 °C，玉米芯浓度5%的条件下吸附30 min，90.3%融合蛋白特异性的吸附在玉米芯上。

（3）吸附有融合蛋白的玉米芯直接进行酶解反应，72 h后获得了7.51 mg/mL的还原糖，通过TLC检测主要是纤维二糖和纤维三糖。

关键词：融合酶 低聚木糖 双歧杆菌

Construction and expression of Expansin xylanase fusion enzyme

Abstract

Xylooligosaccharides (XOS) is a kind of prebiotics, the intestinal flora beneficial bacteria - Bifidobacterium (Bifidobacterium) proliferation effect is obvious, so increase the Bifidobacterium in the human intestinal content is particularly important. In this paper, we constructed the loose protein-xylanase fusion protein (EXLX-XYN), and prepared the oligosaccharide xylose by adsorption-catalysis coupling technique. The xylanase, which adds loose protein (Expansin), is tightly adsorbed on the substrate corncob and pure fusion protein can be obtained by simple cleaning. preparation of high purity xylo - sugar by one - step Adsorption - catalytic coupling reaction. The main results of this paper are as follows:

（1）the use of gene overlap extension technology, the integration of the expansion of protein - xylanase gene, and in E. coli to achieve heterologous expression. The xylanase activity of the supernatant was 156.8 U / mL and the apparent molecular weight was 40 kDa. The results showed that the effect of rigid linker peptide (EAAAK) 2 was the best, and the activity of xylanase was up to 289.3 U / mL, which was 1.4 times of that of natural xylanase. Enzyme activity of 52.7 U / mL, 1.3 times the natural xylanase

（2） adsorption-catalyzed coupling reaction in the preparation of high purity xylo-oligosaccharides. Adsorption was carried out for 30 min and 90.3% of the fusion protein was adsorbed on the corn cob under the optimum conditions of adsorption pH of 7.0, adsorption temperature of 20 ° C and corn core concentration of 5%.

（3） The mitochondroin was directly digested with the fusion protein, and the reducing sugar was 7.51 mg / mL after 72 h. The main method was determined by TLC

KeyWords:  fusion enzyme；Bifidobacterium；Xylo-oligosaccharide

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1松散蛋白的简介 1

1.2木聚糖酶的简介 1

1.3融合酶的现状 2

1.4低聚木糖的应用 3

1.5研究的目的和意义 3

第二章 实验材料和方法 4

2.1 实验材料 4

2.1.1所用菌株与质粒 4

2.1.2实验仪器与设备 4

2.2实验方法 5

2.2.1 松散蛋白-木聚糖酶融合酶的构建 5

2.2.2松散蛋白-木聚糖酶融合酶表达载体的构建 6

2.2.4 木聚糖酶的表达 10

2.3 松散蛋白-木聚糖酶融合蛋白酶活鉴定以及SDS-PAGE鉴定 10

2.3.1木聚糖酶酶活测定 10

2.3.2 SDS-PAGE制备方法 11

2.4 融合蛋白对玉米芯吸附条件的优化 11

2.5 松散蛋白-木聚糖酶融合蛋白吸附玉米芯情况表征 11

2.6 松散蛋白-木聚糖酶融合蛋白酶解玉米芯生产低聚木糖 12

第三章 结果与讨论 13

3.1 松散蛋白-木聚糖酶融合蛋白基因的构建和表达载体构建 13

3.2 松散蛋白-木聚糖酶融合蛋白的表达鉴定 14

3.3 融合蛋白EXLX-R2-XYN吸附玉米芯的条件优化 16

3.4 融合蛋白EXLX-R2-XYN吸附玉米芯的表征 17

3.5融合蛋白EXLX-R2-XYN酶解玉米芯产低聚木糖 18

3.6展望 19

参考文献 21

致 谢 24

文献综述

1.1 松散蛋白的简介

近年来，在植物细胞壁中发现一类被称为松散蛋白（expansin）的蛋白新家族，Expansin的发现起始于对黄瓜下胚轴细胞壁酸诱导伸展的研究^[1]。 Expansin被认为可以破坏纤维素的微纤维之间或纤维素和其它细胞壁多糖之间的氢键而且没有水解活性^[2]。在以往的研究中发现，Expansin虽然不能直接水解纤维素，但却可以增强酶活活性。

在枯草芽孢杆菌中发现了一种与植物Expansins序列相似的蛋白，被命名为EXCL。在水解微晶纤维素时，虽然Expansins等松散蛋白自身缺乏水解活性，但与纤维素酶共同作用时水解活力可提高50%^[3]。它对水解酶的活性促进作用表明Expansin能够从纤维素表面除去多糖链，使纤维素酶接触更多的底物，同时使微纤维表面的葡聚糖对纤维素酶的攻击更为敏感，提高纤维素酶对纤维素的水解活性^[4]

1.2 木聚糖酶的简介

木聚糖是一种存在于植物细胞壁中的异质多糖，大部分的木聚糖结构复杂，含有多个不同的取代基^[5-6]。木聚糖酶就是用来水解木聚糖的。按反应方式区分，木聚糖酶有3种，一种是作用于主链的内部的内切木聚糖酶；第二种则是与之相反，作用于木聚糖和低聚木糖非还原端的外切木聚糖酶；最后一种作用于低聚木糖非末端木糖苷酶。三种酶作用部位不同，产生的物质也不完全相同。现如今，木聚糖酶对于生产生活更加重要，应用随处可见，食品，复杂，造纸等行业都有广泛运用，体现出了其具有重要的价值^[7]。不同的行业对于木聚糖酶的需求也是各不相同的，针对于不同行业对其的不同需求，研究木聚糖酶愈发引起人类和社会的关注。

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