论文总字数：17429字

摘 要

核苷类药物在病毒性疾病中发挥积极地作用。人类的很多疾病是由病毒引起的，严重危害人类的身体健康。然而在最近不断发现的有效化合物和抗病毒药物中，虽然活性化合物在在天然产物中比较常见，但是到现在为止还没有发现有效且能用于临床的药物。而近几年抗病毒药物特别是核苷酸衍生物，大多得到了临床使用的批准。尤其是1980年以来出现的许多具有较高效率且毒性较小的的开环核苷酸化合物，给人类寻找新的抗病毒药物指引了新的方向。

酶合成法核苷类似物具有很多优点,如反应条件比较平和，因此操作安全性较高，产物简单。并且反应具有较强的专一性，副反应较少。根据底物和产物筛选高活性的菌株，利用PCR技术对这类酶进行扩增，利用基因工程构建含有符合条件的高活性酶的目标菌株，从而达到解决酶量的问题。

本课题是利用简单芽孢杆菌为实验对象，提取基因组序列，并通过PCR扩增获得尿苷磷酸化酶的基因。随后，我们研究该酶的酶学性质，如最适pH和酶在不同pH中的稳定性、最适温度和酶在不同温度中的稳定性、不同金属离子对酶活力的影响以及不同有机溶剂对稳定性的影响。

关键词：尿苷磷酸化酶 简单芽孢杆菌 克隆表达 酶学性质

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Abstract

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Nucleoside drugs play an active role in viral diseases. Many human diseases are caused by virus, which seriously harm human health. However, in the discovery of therapeutic compounds and antiviral drugs, although there are active compounds exist in the natural nucleosides , but there are no effective drugs used in clinical therapy.In recent years, antiviral drugs, especially nucleotide derivatives, have been approved to be effective in clinical therapy. Many open-loop nucleotide compounds have been found since 1980, which were efficient and less toxic. They provided a new direction to find new antiviral drugs.

The enzymatic synthesis of nucleoside analogues has many advantages, such as mild reaction condition, including low temperature and low pressure, so the process is easy to operate. These reactions have substrate specificity, no side products are produced. And then the screening of strains was based on the activity of substrate. The gene encoding enzyme was amplified by PCR and the recombinant strain was constructed to promote the expression of enzyme.

In this study, we extracted the genome of Bacillus simplex and amplified the gene encoding uridine phosphorylase by PCR. Then we investigated the characteristics of uridine phosphorylase, such as the effect of pH on the activity and stability, optimum temperature and thermal stability, effects of metal ions and organic solvents on the activity and stability of uridine phosphorylase.

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Key Words: Uridine phosphorylase；Bacillus simplex；

Cloning and expression；Enzymatic properties

目 录

第一章 文献综述 1

1.1 核苷类药物概述 1

1.1.1核苷类化合物及其现状 1

1.1.2 核苷类化合物的合成 1

1.2 核糖磷酸化酶 2

1.3本课题的研究内容 2

第二章 实验材料与方法 3

2.1 实验材料 3

2.1.1 实验试剂 3

2.1.2 菌株与质粒 4

2.1.3 培养基 4

2.1.4 仪器与设备 4

2.1.5 凝胶电泳试液配制 5

2.2 实验方法 6

2.2.1简单芽孢杆菌的活化、培养和保藏 6

2.2.2基因组提取 6

2.2.3 基因组验证 7

2.2.4引物设计 7

2.2.5克隆引物PCR产物胶回收 8

2.2.6表达引物PCR及其胶回收 9

2.2.7提pET-28a质粒 9

2.2.8双酶切 10

2.2.9 重组和转化 11

2.2.10 菌落PCR 11

2.2.11 酶学性质的研究 12

第三章 结果与展望 14

3.1结果与讨论 14

3.1.1 核苷磷酸化酶的PCR扩增 14

3.1.2 酶学性质的研究 14

3.1.3 结论 17

3.2 展望 18

参考文献 19

致谢 21

第一章 文献综述

1.1 核苷类药物概述

1.1.1核苷类化合物及其现状

核苷化合物是由核糖或脱氧核糖组成，并在其核糖的C1位上连一个碱基（嘌呤或嘧啶），从而形成的一系列化合物的统称。核苷类化合物在碱基和戊糖部分，存在多种修饰，根据修饰的基团不同可分为很多种类。

核苷化合物在各个领域具有广泛的应用,并在治疗病毒性疾病中发挥积极地作用。人类的很多疾病是由病毒引起的，据世界卫生组织统计，将近百分之六十的的流行性传染病是由病毒感染引起的^[1]。如肝炎、疤疹性脑炎、眼角膜炎以及艾滋病、SARS、甲型H1N1等危害性极大的疾病。然而在最近发现的有效化合物和抗病毒药物中，虽然活性化合物在天然产物中比较常见，但是到现在为止还没有发现有效且能用于临床的药物。而抗病毒作用活性最高的的苯并咪唑类化合物，目前也未能通过临床的考验^[2]。相反，核苷酸衍生物大多得到了批准。尤其是1980年以来出现的许多具有较高效率且毒性较小的的开环核苷酸化合物，给人类寻找新的抗病毒药物指引了新的方向，为人类发展做出了巨大的贡献。这些药物通过三种途径发挥作用^[3]：①首先是进入细胞内并被代谢成活性成分，抑制核苷酸合成途径中的某些酶，起到影响dNTPs的作用，从而对DNA复制产生抑制作用;②被代谢成相关的核苷三磷酸进入到DNA链或者RNA链中，终止链的延伸;③在核酸合成中，许多酶起到关键性的作用，核苷类药物通过抑制这些酶，从而抑制核酸的合成，因而起到抑制肿瘤细胞生长的结果。人类通过这些途径，不断研究和发展核苷酸衍生物，使其在抗肿瘤的发展中发挥重大作用。

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